TLR4基因沉默对兔颈动脉粥样硬化斑块血管生及细胞凋亡的影响及机制探讨

发布时间：2017-09-09 08:17

  本文关键词：TLR4基因沉默对兔颈动脉粥样硬化斑块血管生及细胞凋亡的影响及机制探讨

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【摘要】：背景:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心肌梗死、脑卒中和外周血管疾病的主要病理基础,具有发病率高、致残率高、治疗费用高的特点。目前,心血管疾病位居人类各种致死病因的首位。因而动脉粥样硬化的防治具有重大的经济效益和社会效益。AS发病机制复杂,具有多种学说。目前研究认为AS是一种发生在血管壁的慢性炎症性疾病,以血管壁内脂质沉积、炎症细胞聚集为特征,免疫反应贯穿于AS的始终。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)作为一种模式识别受体参与了AS的形成和发展。易损斑块(vulnerable plaque,VP)的破裂是急性心血管事件的主要原因,影响易损斑块的原因包括:脂质核心的大小、纤维帽的厚度、炎症反应和血流动力学等。研究发现,动脉粥样硬化斑块中的新生血管是影响斑块稳定性的核心事件,并贯穿于AS发生发展乃至斑块破裂的整个过程。动脉粥样硬化斑块中存在着多种细胞凋亡和坏死。因而抑制斑块内血管新生和减少细胞凋亡是稳定斑块、防止斑块破裂的重要手段。目的:新生血管和细胞凋亡在动脉粥样硬化的发生发展乃至破裂过程中发挥重要作用。本实验拟应用si RNA沉默Toll样受体4(TLR4)基因,观察兔颈动脉粥样斑块中血管新生和细胞凋亡情况,为动脉粥样硬化的防治提供新的机制和思路。方法:本研究分二部分1.应用高脂喂养联合球囊损伤构建兔颈动脉粥样硬化模型:健康长耳白兔48只,随机分为对照组(control group)、模型组(model group)、TLR4阴性对照组(si RNA-negative group)、TLR4下调组(si RNA-TLR4 group)。(1)于喂养起始、5周、10周时取血,集中测定血脂水平;(2)留取颈动脉标本,进行病理学切片HE染色,测量内膜、中膜厚度,计算斑块面积百分比;免疫组化测定斑块内CD31、缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达情况;TUNEL法检测斑块内细胞凋亡情况;(3)Real-time PCR测定TLR4、NF-κB、HIF-1α、VEGF m RNA表达情况;(4)Western-blot测定TLR4、NF-κB、HIF-1α、VEGF蛋白表达情况;(5)ELISA测定血清TNF-α、IL-6水平。2.体外培养人脐静脉内皮细胞(human vein umbilical vein endothelial cell,HUVEC)。(1)脂多糖(LPS)以不同时间、浓度刺激HUVEC,观察TLR4 m RNA表达达峰情况;(2)应用流式细胞仪技术,LPS以1μg/ml、10μg/ml刺激HUVEC0h、6h、24h、36h、48h观察细胞凋亡情况;(3)设计合成两条针对HUVEC TLR4的sh RNA,以慢病毒为载体包装sh RNA-TLR4质粒转染HUVEC,此后分为三组,control group、sh RNA1-TLR4 group和sh RNA2-TLR4 group。应用LPS 1μg/ml刺激24h,检测TLR4 m RNA和蛋白表达情况,计算抑制效率;检测NF-κB、HIF-1α、VEGF m RNA和蛋白表达情况(4)MTT法检测LPS刺激前后control group、sh RNA1-TLR4 group和sh RNA2-TLR4 group三组细胞增殖情况;流式细胞仪测定细胞周期分布情况;(5)划痕愈合实验(Wound healing)实验测定LPS刺激前后三组细胞迁移能力;(6)成管实验观察三组细胞成管能力。结果:1.(1)颈总动脉球囊损伤模型:手术成功率81.8%;(2)高脂喂养后兔血脂水平明显升高,但各组同一时点无统计学差异(p0.05);(3)HE染色结果显示,实验组大部分颈总动脉有粥样硬化斑块形成,si RNA-TLR4组较其他各组内膜/中膜厚度比、斑块面积百分比减少;免疫组化提示颈总动脉粥样斑块内有CD31、HIF-1α表达,且在si RNA-TLR4组的表达小于其他各组;TUNEL法染色提示,实验各组斑块内有细胞凋亡的发生,si RNA-TLR4组的表达小于其他各组(p0.05);(4)RT-PCR、Western-blot提示si RNA-TLR4组的TLR4、NF-κB、HIF-1α、VEGF表达水平较模型组下降(p0.05)。2.(1)LPS刺激HUVEC,激活TLR4具有浓度和时间依赖性,结果发现LPS 1μg/ml刺激24小时可使TLR4的表达达到峰值;(2)流式细胞术分析发现,LPS 1μg/ml或10μg/ml刺激HUVEC 6小时会使细胞凋亡达到峰值;sh RNA组的细胞凋亡率下降(p0.05);(3)RT-PCR、Western-blot提示sh RNA-TLR4组的TLR4、NF-κB、VEGF表达下降(p0.05),而HIF-1α表达水平无明显差异(p0.05);(4)细胞功能实验发现,sh RNA-TLR4组的细胞增殖能力下降(p0.05),成管能力低于对照组(p0.05),而迁移能力无统计学差异(p0.05)。结论:1.球囊损伤联合高脂喂养兔10周可以成功建立兔颈动脉粥样硬化模型;si RNA-TLR4可通过抑制TLR4、NF-κB信号通路的活化减弱下游炎症因子TNF-α、IL-6的表达而抑制炎症反应,抑制HIF-1α、VEGF的表达而减少粥样斑块内新生血管的发生,并减少细胞凋亡的发生从而稳定斑块;TLR4基因沉默稳定斑块的作用独立于降脂效应。2.LPS刺激HUVEC激活TLR4具有浓度和时间依赖性;LPS刺激HUVEC可使细胞达到凋亡,sh RNA-TLR4可通过抑制TLR4、NF-κB信号通路活化使细胞凋亡率下降;LPS刺激细胞后可通过活化TLR4、NF-κB信号通路使VEGF表达增加进而促进新生血管生成,而sh RNA下调TLR4后可弱化这种效应,并不通过HIF-1α传递这种效应;下调TLR4基因抑制细胞增殖,而对迁移能力无明显影响。
【关键词】：Toll样受体4 动脉粥样硬化 RNA干扰 信号通路 血管新生 细胞凋亡
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.4
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-14
• 前言14-17
• 研究现状、成果14-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、TLR4基因沉默对兔颈动脉粥样硬化斑块血管新生和细胞凋亡的影响17-60
• 1.1 对象和方法17-33
• 1.1.1 实验动物17
• 1.1.2 实验材料及仪器17-21
• 1.1.3 实验方法21-33
• 1.2 结果33-45
• 1.2.1 模型建立情况33-37
• 1.2.2 病理分析结果37-41
• 1.2.3 RT-PCR测定TLR4信号通路分子mRNA表达41-43
• 1.2.4 Western-blotting检测TLR4信号通路分子蛋白的表达43-45
• 1.2.5 ELISA检测血清TNF-α、IL-1β 表达水平45
• 1.3 讨论45-59
• 1.3.1 动脉粥样硬化模型的建立45-47
• 1.3.2 RNA干扰技术47-51
• 1.3.3 TLR4介导信号通路与动脉粥样硬化51-53
• 1.3.4 TLR4介导信号通路与斑块内血管新生53-57
• 1.3.5 TLR4介导信号通路与斑块内细胞凋亡57-59
• 1.4 小结59-60
• 二、RNAi下调TLR4对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移、成管及凋亡的影响60-88
• 2.1 对象和方法60-71
• 2.1.1 对象60-62
• 2.1.2 方法62-71
• 2.2 结果71-81
• 2.2.1 HUVEC生长曲线71-72
• 2.2.2 脂多糖对血管内皮细胞的形态学影响72
• 2.2.3 不同浓度LPS及不同刺激时间对HUVEC TLR4活性的影响72-73
• 2.2.4 shRNA-TLR4质粒的构建及慢病毒的包装73
• 2.2.5 RT-PCR测定TLR4信号通路分子mRNA表达73-74
• 2.2.6 Western-blotting检测TLR4信号通路分子蛋白的表达74-76
• 2.2.7 细胞功能实验76-81
• 2.2.7.1 划痕实验76
• 2.2.7.2 MTT76-77
• 2.2.7.3 细胞周期检测77-78
• 2.2.7.4 细胞成管能力检测78-79
• 2.2.7.5 细胞凋亡检测79-81
• 2.3 讨论81-87
• 2.3.1 内皮细胞的主要生理功能及与动脉粥样硬化的关系82
• 2.3.2 下调TLR4对HUVEC细胞TLR4信号通路的影响82-83
• 2.3.3 TLR4基因对内皮细胞增殖能力的影响及可能机制83-84
• 2.3.4 TLR4基因对内皮细胞迁移能力的影响及可能机制84
• 2.3.5 TLR4基因对内皮细胞成管的影响及可能机制84-85
• 2.3.6 TLR4基因对内皮细胞凋亡的影响及可能机制85-87
• 2.4 小结87-88
• 全文总结88-89
• 论文创新点89
• 局限性89-90
• 参考文献90-100
• 发表论文和参加科研情况100-101
• 综述 血管新生与动脉粥样硬化研究进展101-111
• 综述参考文献106-111
• 致谢111

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;Cost-effective method of siRNA preparation and its application to inhibit hepatitis B virus replication in HepG2 cells[J];World Journal of Gastroenterology;2005年09期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 丁士芳;新生血管与斑块稳定性的关系及VEGF基因干预的研究[D];山东大学;2007年

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本文编号：819304