神经导向因子netrin-1联合外周血间充质干细胞对动脉硬化闭塞症大鼠血管生成能力影响的研究

发布时间：2017-09-09 17:37

  本文关键词：神经导向因子netrin-1联合外周血间充质干细胞对动脉硬化闭塞症大鼠血管生成能力影响的研究

  更多相关文章： 间充质干细胞 netrin-1 动脉硬化闭塞症 血管新生 外周血

【摘要】：背景：周围血管疾病(peripheral arterial disease, PAD)是指发生于除了心、脑血管之外的疾病,主要包括动脉狭窄和阻塞性疾病。近年来周围血管疾病随着高危因素的不断升高其发病率有愈来愈高的趋势[1]。动脉粥样硬化可发生于全身任何动脉血管,动脉硬化闭塞症(arteriosclerosis obliterans, ASO)只是其在肢体局部的表现,随着病情的进展,可使肢体出现相应的缺血症状,影响患者的生活质量和预后。动脉硬化闭塞症的治疗主要包括非手术治疗和手术治疗。虽然手术和介入治疗已成为外周动脉疾病治疗的首选方案,但仍有约30%的患者因为治疗风险过大而不得不放弃[2]。Asahara等人早在1997年便发现了一种新的促进血管生成的疗法,并且拉开了干细胞治疗的序幕[3]。随着干细胞移植的深入开展,发现通过具有多向分化潜能的间充质干细胞移植可以促进缺血肢体的血管新生,使缺血肢体的血供得到部分改善,从而缓解临床症状[2,4-8]。虽然干细胞用手临床治疗已有超过10年的经验,但现阶段也有亟需克服的困难,比如需要反复多次移植。近年来一些原本认为与血管新生无关的物质,随着研究的深入,也被发现有促血管新生的功能,比如netrins蛋白家族。研究表明,netrins家族及其受体在许多非神经组织中均有表达,比如血管,提示netrins蛋白并不只在中枢神经系统的发育过程中发挥重要作用[9,10]。虽然netrins能发挥促血管生成作用,但其机制目前尚未完全明确。目的：将间充质干细胞从动脉硬化闭塞症SD大鼠的外周血中分离出来,并在体外进行培养,再应用重组netrin-1蛋白联合培养的外周血间充质干细胞移植到动脉硬化性闭塞症大鼠模型局部缺血组织,观察局部缺血肢体的血供恢复情况。同时在体外通Transwell细胞迁移实验和小管形成实验来观察netrin-1对血管的促生成作用,探讨netrin-1对于动脉硬化闭塞症可能产生的作用,为动脉硬化闭塞症的非手术疗法提供新的思路和理论依据。方法：在体内研究中,将36只老年大鼠制成重度缺血的动脉硬化闭塞症模型后,分为4组,netrin-1+干细胞组(采用netrin-1+间充质干细胞联合治疗)、干细胞组(单独使用间充质干细胞治疗)、netrin-1组(单独使用netrin-1治疗)和空白对照组(使用0.9%氯化钠注射液治疗)。将分离并培养的外周血间充质干细胞以及netrin-1根据分组局部注射到缺血组织中。在治疗后第7、14和28天分别观察Tarlov评分、应用的实时荧光定量聚合酶链式反应测定组织内血管内皮生长因子的表达以及应用免疫荧光染色测定毛细血管密度。在治疗第28天时,测定各组的腓肠肌平均最大等长收缩力的测定。在体外研究中,通过Transwell细胞迁移实验来观察不同浓度的netrin-1对间充质干细胞迁移的影响,同时通过小管形成实验观察不同浓度的netrin-1对人脐静脉内皮细胞小管形成作用的影响。结果：在体内研究中,治疗后第7天和第14天,各组之间的Tarlov评分相比较,P0.05,差异无统计学差异。治疗后第28天,netrin-1组、干细胞组、netrin-1--干细胞组的行为评分分别为3.1±0.6、3.4±0.5、4.1±0.6,均高于对照组的评分2.2±0.4,P0.01,差异有显著统计学意义。干细胞组和netrin-1干细胞组的行为评分在第28天有统计学差异(P=0.024)。治疗后第7、14、28天,各实验组的血管内皮生长因子表达均比对照组高,P0.01,差异有显著统计学意义。同时Netrin-l+干细胞组在第7、14、28天的血管内皮生长因子表达水平显著高于nettin-1组和干细胞组的血管内皮生长因子表达水平,P0.01,差异有显著统计学意义。治疗后第14、28天,各实验组的平均毛细血管密度均比对照组高,P0.01,差异有显著统计学意义。在治疗后第28天,netrin-1+干细胞组的平均毛细血管密度要显著高于干细胞组的平均毛细血管密度,P0.01,差异有显著统计学意义。同时,netrin-1+干细胞组的平均最大收缩力要高于干细胞组的平均最大收缩力,P=0.014,差异有统计学意义。在体外研究中,不同浓度netrin-1组的细胞迁移数量和小管形成数量要比对照组明显增多,P0.01,差异有统计学意义。随着netrin-1浓度的升高,发生迁移的间充质干细胞数量和和小管形成数量也随之增加。结论：Netrin-1联合自体间充质干细胞移植治疗能够提高单纯自体间充质干细胞移植治疗的效果,联合治疗的动脉硬化闭塞症大鼠能获得更高的Tarlov评分,拥有更高的血管内皮生长因子表达,通过治疗,其缺血组织内的毛细血管密度更高,而且肌力恢复的更快速。通过体外实验观察到,netrin-1能诱导趋化间充质干细胞并能促进其血管生成过程。
【关键词】：间充质干细胞 netrin-1 动脉硬化闭塞症 血管新生 外周血
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543
【目录】：

• 缩略词表7-8
• 目录8-9
• 中文摘要9-11
• ABSTRACT11-12
• 引言12-17
• 第一部分 netrin-1联合外周血间充质干细胞对动脉硬化闭塞症大鼠的血管新生观察17-43
• 1 前言17-20
• 2 材料和方法20-30
• 3 结果30-36
• 4 讨论36-43
• 第二部分 体外观察netrin-1对动脉硬化闭塞症大鼠间充质干细胞的血管新生的影响43-61
• 1 前言43-46
• 2 材料与方法46-53
• 3 结果53-58
• 4 讨论58-61
• 结论61-62
• 参考文献62-66
• 综述66-81
• 参考文献77-81
• 攻读博士学位期间发表的科研论文81

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