角膜上皮抗真菌免疫过程中TLR2对NOD2的调控及NOD2的作用

发布时间：2017-09-09 21:10

  本文关键词：角膜上皮抗真菌免疫过程中TLR2对NOD2的调控及NOD2的作用

  更多相关文章： 核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2 胞壁酰二肽 烟曲霉菌 永生化人角膜上皮细胞 炎性细胞因子 核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2 Toll样受体2 酵母聚糖 烟曲霉菌 永生化人角膜上皮细胞

【摘要】：真菌性角膜炎(fungal keratitis, FK)是导致视力损伤甚至失明的重要原因。在全球范围内,约65%的角膜溃疡是由真菌性角膜炎引起的。在农业国家如中国和印度,角膜创伤是诱发真菌性角膜炎的主要原因。角膜创伤可以将真菌孢子直接带入角膜基质层,也可以通过破坏角膜上皮屏障的方式导致角膜直接暴露在致病性真菌前。其他诱因还包括免疫功能低下、皮质类固醇使用史和角膜接触镜的佩戴。镰刀菌属和曲霉菌属是导致真菌性角膜炎最主要的两类病原体。大面积溃疡,前房积脓和曲霉菌感染往往是导致治疗失败的原因。此外,以往的研究表明,在曲霉菌性角膜炎患者中,42-60%需要进行角膜移植术,而相比之下,镰刀菌性角膜炎患者仅有23-32%需要进行角膜移植术。因此在本研究中,我们选择了烟曲霉菌(Aspergillus fumigates)作为角膜感染模型的病原体,具有重要的临床意义。哺乳动物体内存在多种模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs),其中包括toll样受体(toll-like receptors, TLR)和核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors, NLRS)。PRRs通过识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)引发细胞内的信号级联传导,进而启动天然免疫。TLRs位于细胞膜上,其家族中的TLR2可以识别包括酵母聚糖(zymosan, Zym)在内的多种配体(除TLR2外,酵母聚糖还可被Dectin-1识别);NLRs位于细胞内,其家族中的NOD2可识别肽聚糖(peptidoglycan, PGN)的衍生物胞壁酰二肽(muramyl dipeptide, MDP),而PGN是革兰氏阳性和阴性细菌的组分之一。在识别配体后,NOD2和TLR2均可通过核转录因子κB (NFκB)信号通路引起炎症介质的转录表达。在上述过程中,受体相互作用蛋白2 (receptor interacting protein 2, RIP2)是NOD2信号传导通路的关键分子：NOD2与RIP2结合使后者与IκB激酶(inhibitory κB kinase, IKK)的亚基IKKγ相互作用,导致IKK复合物激活。IKK复合物使IκB-α泛素化降解,释放出的游离NFκB转位入核进而激活下游通路。已有文献证实TLR2和NOD 2在角膜上皮细胞中有基础表达；我们在预实验中发现,加热灭活的烟曲霉菌孢子可以提高TLR2和NOD2的表达。以往的研究还证实,TLR2在烟曲霉菌性角膜炎中起重要作用,其活化能激活下游信号转导通路,促进炎性因子如白介素(interleukin, IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等的产生。鉴于TLR2和NOD2均能激活NFκB信号传导途径,我们意图揭示TLR2和NOD2在永生化人角膜上皮细胞(human corneal epithelial cells, HCECs)抗烟曲霉菌的过程中是否存在交叉对话；NOD2在HCECs抗烟曲霉菌免疫过程中是否发挥作用。我们的研究结果表明,酵母聚糖可通过依赖TLR2的途径增加NOD2的表达；使用酵母聚糖预处理可以减少MDP引起的炎性细胞因子的分泌。此外,烟曲霉菌孢子也通过部分依赖TLR2的方式促进NOD2和RIP2的表达。使用小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)敲除NOD2后,烟曲霉菌孢子引起的炎性因子分泌减少。上述结果有助于我们加深对真菌性角膜炎天然免疫机制的了解,揭示了NOD2在真菌性角膜炎中的作用,为真菌性角膜炎的治疗指出新的研究方向。第一部分NOD2在HCECs中的表达[目的]研究NOD2在HCECs中的基础表达,及NOD2配体MDP、烟曲霉菌对NOD2表达的影响。[方法]1.细胞的获取和培养：HCECs由韦恩州立大学的Fu-Shin X.Yu教授慷慨提供。细胞在37℃、含5%CO2的湿润的细胞温箱中孵育。细胞培养基采用新生牛血清的改良Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)/F12与不含血清的角质形成细胞培养基(keratinocyte serum free medium, KSFM)按照1：1的比例配制而成。细胞以1×105个／孔的浓度接种于6孔微培养板上,用于后续实验。2.烟曲霉菌菌株的获取和孢子的制备：烟曲霉菌菌株CCTCC 93024购自中国典型培养物保藏中心。将菌种接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上,37℃条件下培养4天。轻柔刮取培养基表面的孢子并在含0.05% Tween 80的PBS(phosphate-buffered saline)中制备成孢子混悬液。使用四层无菌纱布过滤该混悬液以达到去除烟曲霉菌菌丝和其他残留物,提纯孢子的目的。取过滤后的孢子混悬液,56℃加热60min使孢子失活,使用血球计数板计数,稀释制成1×105/ml的孢子混悬液。3.细胞的刺激：使用灭活的烟曲霉菌孢子(1×105/m1)刺激HCECs,经12h或24h后收取细胞,荧光定量实时聚合酶链反应(real time-polymerase chain reaction, RT-PCR)和western blotting检测TLR2、NOD2的水平。使用NOD2的配体MDP(10μg/ml)刺激HCECs,经12h或24h后收取细胞及培养上清,RT-PCR和western blotting检测NOD2及下游关键分子RIP2、NFκB-p65和IκB-α的表达水平,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测IL-6、IL-8和TNF-α的分泌,免疫荧光检测转录因子NFκB-p65向细胞核内的转移。[结果]1. HCECs中TLR2与NOD2的mRNA和蛋白水平均在接受烟曲霉菌孢子刺激后有所提高。2.使用MDP刺激HCECs后,NOD2及其下游关键分子RIP2、NFKB-p65和IκB-α表达均升高,NFκB-p65转位入核增多,IL-6、IL-8和TNF-α分泌增加。[结论]1.烟曲霉菌孢子可以上调HCECs中TLR2与NOD2的表达。2.MDP可以激活NOD2及下游NFκB通路,提高炎性细胞因子的分泌水平。于后续实验。2.烟曲霉菌菌株的获取和孢子的制备：烟曲霉菌菌株CCTCC 93024购自中国典型培养物保藏中心。将菌种接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上,37℃条件下培养4天。轻柔刮取培养基表面的孢子并在含0.05% Tween 80的PBS(phosphate-buffered saline)中制备成孢子混悬液。使用四层无菌纱布过滤该混悬液以达到去除烟曲霉菌菌丝和其他残留物,提纯孢子的目的。取过滤后的孢子混悬液,56℃加热60min使孢子失活,使用血球计数板计数,稀释制成1×105/ml的孢子混悬液。3.细胞的刺激：使用灭活的烟曲霉菌孢子(1×105/m1)刺激HCECs,经12h或24h后收取细胞,荧光定量实时聚合酶链反应(real time-polymerase chain reaction, RT-PCR)和western blotting检测TLR2、NOD2的水平。使用NOD2的配体MDP(10μg/ml)刺激HCECs,经12h或24h后收取细胞及培养上清,RT-PCR和western blotting检测NOD2及下游关键分子RIP2、NFκB-p65和IκB-α的表达水平,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测IL-6、IL-8和TNF-α的分泌,免疫荧光检测转录因子NFκB-p65向细胞核内的转移。[结果]1. HCECs中TLR2与NOD2的mRNA和蛋白水平均在接受烟曲霉菌孢子刺激后有所提高。2.使用MDP刺激HCECs后,NOD2及其下游关键分子RIP2、NFKB-p65和IκB-α表达均升高,NFκB-p65转位入核增多,IL-6、IL-8和TNF-α分泌增加。[结论]1.烟曲霉菌孢子可以上调HCECs中TLR2与NOD2的表达。2.MDP可以激活NOD2及下游NFκB通路,提高炎性细胞因子的分泌水平。第二部分TLR2对NOD2在HCECs抗烟曲霉菌免疫中的表达和下游通路的影响[目的]研究单纯使用TLR2配体酵母聚糖刺激HCECs对NOD2表达的影响,并验证上述影响是否通过TLR2发挥作用。研究酵母聚糖预处理对NOD2配体MDP、烟曲霉菌引起的NOD2通路激活的影响。[方法]1.细胞的刺激：使用不同浓度的酵母聚糖和经热碱处理过的酵母聚糖(10μg/ml,仅能被Dectin-1识别)分别刺激HCECs,经12h或24h后收取细胞,RT-PCR和western blotting检测NOD2、RIP2的水平。使用不同浓度的酵母聚糖预处理HCECs 12h后,更换细胞培养液,37℃条件下MDP (10μg/ml)刺激12h或24 h,收取细胞和培养上清,RT-PCR和western blotting检测NOD2、RIP2的表达水平,ELISA检测IL-6、IL-8和TNF-α的分泌。2.抗体阻断：HCECs与抗人TLR2(100 μg/ml)单克隆抗体共孵育4h后,更换培养液,37℃条件下灭活的烟曲霉菌孢子(1×10S/m1)刺激12 h或24 h,收取细胞及培养上清,RT-PCR和western blotting检测NOD2.RIP2的表达水平,ELISA检测IL-6、IL-8和TNF-α的分泌,免疫荧光检测转录因子NFκB-p65向细胞核内的转移。3.RNA干扰：利用GenBank库查找NOD2 DNA中的三组目的序列,针对这三组序列,使用WI siRNA筛选程序(WI siRNAselection program)制作三条NOD2siRNA和一条用作对照的scramble siRNA(随机打乱序列的RNA)。将细胞接种于6孔微培养板上,当细胞融合率达到50-60%时,每孔使用50nM siRNA,通过Lipofectamine 2000试剂在Opti-MEM减血清培养基中转染细胞。转染6h和12h后收取细胞使用RT-PCR和western blotting检测NOD2及下游RIP2表达情况,确定敲减效果。选取敲减效果最佳的一条siRNA,转染HCECs 4h后,更换细胞培养液,37℃条件下灭活的烟曲霉菌孢子(1×105/m1)刺激24 h,收取培养上清,ELISA检测IL-6、IL-8和TNF-a的分泌。[结果]1.酵母聚糖刺激HCECs的最佳浓度是10μg/ml。该浓度的酵母聚糖刺激可有效提高HCECs中NOD2与RIP2的mRNA和蛋白水平,该作用可被TLR2抗体阻断。经热碱处理过的酵母聚糖没有这种作用。2.酵母聚糖预处理HCECs的最佳浓度是10ng/ml。与单纯使用MDP刺激相比,使用该浓度的酵母聚糖预处理后,MDP引起NOD2、RIP2表达提高的能力下降,IL-6、IL-8和TNF-α的分泌减少。3.使用抗体阻断TLR2后,灭活的烟曲霉菌孢子引起NOD2及其下游关键分子RIP2、NFκB-p65和IκB-α表达升高的能力下降,NFκB-p65转位入核减少,但仍高于空白对照组。4. NOD2 siRNA可有效降低NOD2和RIP2的表达。敲减NOD2后,灭活的烟曲霉菌孢子刺激HCECs产生的IL-6、IL-8和TNF-P减少,但仍多于空白对照组。[结论]1.酵母聚糖可以通过依赖TLR2的途径上调HCECs中NOD2与RIP2的表达。2.酵母聚糖预处理可能引起细胞的“交叉耐受”,即TLR2配体激发了细胞耐受性,降低了细胞对NOD2配体的反应,从而使得后续MDP处理引起NOD2、 RIP2表达提高的能力下降,炎性细胞因子分泌减少。3.与酵母聚糖相似,烟曲霉菌孢子也通过部分依赖TLR2的途径上调HCECs中NOD2的表达,激活其下游通路。4. siRNA可成功敲减NOD2。在烟曲霉菌孢子刺激HCECs分泌炎性细胞因子的过程中,NOD2发挥了部分作用。
【关键词】：核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2 胞壁酰二肽 烟曲霉菌 永生化人角膜上皮细胞 炎性细胞因子 核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2 Toll样受体2 酵母聚糖 烟曲霉菌 永生化人角膜上皮细胞
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R772.2
【目录】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 符号说明17-22
• 第一部分 NOD2在HCECs中的表达22-48
• 前言22-23
• 材料和方法23-39
• 结果39
• 讨论39-41
• 结论41-42
• 附图表42-44
• 参考文献44-48
• 第二部分 TLR2对NOD2在HCECs抗烟曲霉菌免疫中的表达和下游通路的影响48-87
• 前言48-49
• 材料和方法49-67
• 结果67-70
• 讨论70-73
• 结论73-75
• 附图表75-81
• 参考文献81-87
• 致谢87-88
• 攻读学位期间发表的学术论文88-89
• 学位论文评阅及答辩情况89-90
• 外文论文190-114
• 外文论文2114-125

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王丽娅;杨子建;张月琴;赵丽娜;;河南地区真菌性角膜炎病因学及流行病学分析[J];中国实用眼科杂志;2006年03期

，

本文编号：822766