根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯治疗系膜增生性肾病的实验研究
发布时间：2017-09-11 13:14
本文关键词：根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯治疗系膜增生性肾病的实验研究
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【摘要】：系膜细胞异常增殖是增生性肾小球疾病共同的病理改变,系膜细胞过度增殖可引起系膜基质增多,最后导致肾小球硬化、终末期肾衰竭的发生。因此,抑制系膜细胞过度增殖可以延缓、阻止肾小球疾病的进展。从2008年开始,本课题组开始探索按照细胞周期动力学原理选用两种可以将细胞周期阻滞于不同时相的免疫抑制剂,联合治疗系膜增生性肾小球疾病,这种用药方案是否具有更好的治疗效果,本课题将予以研究。本实验包括以下五部分:第一部分他克莫司和霉酚酸酯对体外培养的人系膜细胞周期的影响目的:探讨他克莫司和霉酚酸酯对人系膜细胞细胞周期的作用。方法:人系膜细胞分为对照组和用药组,用药组分别加入1μmol/L、5μmol/L的他克莫司或2.5μmol/L、10μmol/L的霉酚酸酯,分别培养24h、48h、72h,用MTT法测细胞增殖、流式细胞仪测细胞周期、流式细胞仪测细胞凋亡。结果:5μmol/L他克莫司作用于人系膜细胞48 h,细胞在S期的比例下降了41%,在G0/G1期的百分比增加,1μmol/L和5μmol/L的他克莫司作用48 h均未对人系膜细胞的细胞凋亡产生影响。2.5μmol/L和10μmol/L的霉酚酸酯作用24,48以及72h均可抑制人系膜细胞的增殖,明显抑制细胞进入G2/M期,2.5μmol/L和10μmol/L的霉酚酸酯作用于人系膜细胞48h均可引起细胞凋亡且呈剂量依赖性,10μmol/L的霉酚酸酯引起的细胞凋亡更明显。结论:他克莫司可以阻断人系膜细胞由G1期进入S期,霉酚酸酯可以阻断人系膜细胞由S期进入G2期,二者可以将细胞周期阻滞于不同时相。第二部分他克莫司和霉酚酸酯抑制人系膜细胞周期性增殖的机制目的:探讨他克莫司和霉酚酸酯抑制人系膜细胞周期性增殖的机制。方法:实验1分为正常对照组(CTL组)、TGF-β1组、正常对照+他克莫司组(CTL+TAC组)、TGF-β1+他克莫司组(TGF-β1+TAC组)。实验2分为正常对照组(CTL组)、PDGF组、正常对照组+霉酚酸酯组(CTL+MMF组)、PDGF+霉酚酸酯组(PDGF+MMF组)。分别用Western blotting法检测各组Smad 2蛋白质的表达、p38蛋白质磷酸化的水平。结果:Western Blotting结果 1:与CTL组相比,TGF-β1组Smad 2蛋白质表达水平显著上调(P0.01);与CTL组相比,CTL+TAC组Smad 2蛋白质表达水平明显下降(P0.01);与TGF-β1组相比,TGF-β1+TAC组Smad 2蛋白质表达水平降低(P0.01)。Western Blotting结果 2:与CTL组相比,PDGF组PP38/P38显著上调(P0.01);与CTL组相比,CTL+MMF组PP38/P38明显下降(P0.01);与PDGF组相比,PDGF+MMF组PP38/P38降低(P0.01)。结论:他克莫司通过影响TGF-β1/Smad 2信号通路从而抑制系膜细胞增殖,霉酚酸酯通过影响p38信号通路从而抑制系膜细胞增殖。第三部分根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制体外培养的人系膜细胞增殖目的:研究与使用单药相比,他克莫司与霉酚酸酯联合使用抑制体外培养的人系膜细胞增殖效果是否更好。方法:人系膜细胞随机分为正常对照组(CTL组)、PDGF组、PDGF+他克莫司组(PDGF+T组)、PDGF+霉酚酸酯组(PDGF+M组)、PDGF+他克莫司组+霉酚酸酯组(PDGF+T+M组)。CTL组为常规培养的HMC;PDGF组用20ng/ml的PDGF刺激HMC,继续培养48h;PDGF+T组用20ng/ml的PDGF刺激HMC,培养24h,用5μmol/L TAC处理细胞,继续培养24h;PDGF+M组:用20ng/ml的PDGF刺激HMC,培养24h,用10μmol/L MMF处理细胞,继续培养24h;PDGF+T+M组:用20ng/ml的PDGF刺激HMC,培养24h,用2.5μmol/L TAC和5μmol/L MMF处理细胞,继续培养24h。采用免疫荧光染色的方法检测Ki67阳性的细胞核比例,采用Western blot的方法检测Cyclin D1蛋白质的表达。结果:免疫荧光染色结果证实,与CTL组相比,PDGF组Ki67阳性的细胞核比例明显升高(P0.01);与PDGF组相比,PDGF+T组和PDGF+M组Ki67阳性的细胞核比例明显下降(P0.01);与PDGF+T组和PDGF+M组相比,PDGF+T+M组Ki67阳性的细胞核比例降低(P0.01);PDGF+T组和PDGF+M组无统计学差异。Western Blotting结果表明,与CTL组相比,PDGF组Cyclin D1蛋白质表达水平显著上调(P0.01);与PDGF组相比,PDGF+T组和PDGF+M组Cyclin D1蛋白质表达水平明显下降(P0.01);与PDGF+T组和PDGF+M组相比,PDGF+T+M组Cyclin D1蛋白质表达水平降低(P0.01)。结论:他克莫司与霉酚酸酯联合使用并且剂量减半,抑制体外培养的人系膜细胞增殖的作用更强。第四部分根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制狼疮性肾炎小鼠系膜细胞增殖目的:研究与使用单药相比,他克莫司与霉酚酸酯联合使用抑制狼疮性肾炎小鼠系膜细胞增殖效果是否更好。方法:随机分为野生型小鼠组(Wt组)、狼疮型小鼠组(Lupus组)、狼疮型小鼠+他克莫司组(Lupus+TAC组)、狼疮型小鼠+霉酚酸酯组(Lupus+MMF组)、狼疮型小鼠+他克莫司+霉酚酸酯组(Lupus+TAC+MMF组)。Lupus+TAC组为狼疮型小鼠使用1mg/kgd TAC腹腔注射;Lupus+MMF组为狼疮型小鼠使用60mg/kgd MMF灌胃;Lupus+TAC+MMF组为狼疮型小鼠使用0.5mg/kgd TAC腹腔注射+30mg/kgd MMF灌胃。Lupus+TAC组、Lupus+MMF组和Lupus+TAC+MMF组从小鼠3月龄时开始用药,6月龄时实验结束,5组实验动物同时处死,留取肾组织进行PAS染色、MASSON染色观察各组肾脏系膜细胞增生的情况,采用免疫组化的方法检测Ki67和PDGF的表达,采用Western blot的方法检测Cyclin D1、PDGF蛋白质的表达。结果:PAS和MASSON染色结果显示,Lupus组小鼠系膜细胞明显增生,Lupus+TAC组、Lupus+MMF组的病理改变较Lupus组有所减轻,Lupus+TAC+MMF组与Lupus+TAC组、Lupus+MMF组相比,系膜细胞增生减轻。免疫组化结果显示,Lupus组可见到Ki67、PDGF表达较Wt组明显增高(P0.01),Lupus+TAC组、Lupus+MMF组较Lupus组的表达显著减少(P0.01),Lupus+TAC+MMF组与Lupus+TAC组、Lupus+MMF组相比,Ki67、PDGF表达明显减少(P0.01)。Western Blotting结果表明,Lupus组可见到Cyclin D1、PDGF表达较Wt组明显增高(P0.01),Lupus+TAC组、Lupus+MMF组较Lupus组的表达显著减少(P0.01),Lupus+TAC+MMF组与Lupus+TAC组、Lupus+MMF组相比,Cyclin D1、PDGF表达明显减少(P0.01)。结论:他克莫司与霉酚酸酯联合使用并且剂量减半,在狼疮性肾炎小鼠体内抑制系膜细胞增殖的作用更强。第五部分根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制狼疮性肾炎患者系膜细胞增殖目的:观察根据细胞周期联合使用他克莫司与霉酚酸酯抑制狼疮性肾炎患者系膜细胞增殖的效果,并且研究该用药方案的治疗效果和不良反应。方法:6例经肾组织穿刺活检明确病理类型为IV型的狼疮性肾炎患者,接受他克莫司(2mg,每天口服两次)、霉酚酸酯(500mg,每天口服两次)、甲基泼尼松龙联合治疗,治疗6个月并进行随访。随访结束后,再次进行肾组织穿刺活检。比较6位患者治疗前后SLADAI评分、24小时蛋白尿、血Scr水平、血白蛋白水平、抗ds DNA抗体、补体C3等临床指标,采用免疫组化法检测肾组织中Ki67、PDGF、Cyclin D1的表达。结果:这6位患者经过他克莫司和霉酚酸酯联合治疗,SLADAI评分、24小时蛋白尿、血Scr水平、血白蛋白水平等临床指标均明显好转,肾脏病理损伤减轻,PDGF、Ki67、Cyclin D1在系膜细胞中的表达明显减少,未发生严重的不良反应。结论:根据细胞周期联合使用他克莫司与霉酚酸酯抑制狼疮性肾炎患者系膜细胞增殖的效果显著,该用药方案的治疗效果较好,不良反应少,安全性高。
【关键词】：他克莫司 霉酚酸酯 系膜细胞 细胞周期 联合用药
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692
【目录】：
- 中文摘要7-13
- 英文摘要13-21
- 中英文缩略表21-22
- 前言22-24
- 参考文献23-24
- 第一部分 他克莫司和霉酚酸酯对体外培养的人系膜细胞周期的影响24-34
- 1 材料与方法25-27
- 1.1 细胞株与试剂25
- 1.2 细胞培养25
- 1.3 MTT法测细胞增殖25-26
- 1.4 流式细胞仪测细胞周期26
- 1.5 流式细胞仪测细胞凋亡26
- 1.6 统计学分析26-27
- 2 结果27-31
- 3 讨论31-32
- 4 参考文献32-34
- 第二部分 他克莫司和霉酚酸酯抑制体外培养的人系膜细胞增殖的机制34-44
- 1 材料与方法35-38
- 1.1 细胞株与试剂35
- 1.2 细胞培养35
- 1.3 实验分组35-36
- 1.4 用药方法36
- 1.5 蛋白印迹(Western blot)36-37
- 1.6 统计学分析37-38
- 2 结果38-41
- 3 讨论41-42
- 4 参考文献42-44
- 第三部分 根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制体外培养的人系膜细胞增殖44-55
- 1 材料与方法45-48
- 1.1 细胞株与试剂45
- 1.2 细胞培养45
- 1.3 实验分组45
- 1.4 用药方法45-46
- 1.5 免疫荧光染色检测Ki67阳性的细胞核比例46
- 1.6 蛋白印迹(Western blot)46-47
- 1.7 统计学分析47-48
- 2 结果48-52
- 3 讨论52-53
- 4 参考文献53-55
- 第四部分 根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制狼疮性肾炎小鼠系膜细胞增殖55-70
- 1 材料与方法56-60
- 1.1 实验动物56
- 1.2 主要仪器和试剂56
- 1.3 实验分组56
- 1.4 实验方法56-57
- 1.5 PAS染色57
- 1.6 MASSON染色57
- 1.7 免疫组化法检测Ki67和PDGF的表达57-58
- 1.8 蛋白印迹(Western blot)58-59
- 1.9 统计学分析59-60
- 2 结果60-67
- 3 讨论67-68
- 4 参考文献68-70
- 第五部分 根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯抑制狼疮性肾炎患者系膜细胞增殖70-83
- 1 资料与方法71-75
- 1.1 研究对象纳入标准71
- 1.2 研究对象排除标准71-72
- 1.3 治疗方法72
- 1.4 注意事项72-73
- 1.5 所有入试患者临床资料73
- 1.6 肾脏病理资料73
- 1.7 主要仪器和试剂73-74
- 1.8 免疫组化法检测肾组织中Ki67、PDGF、Cyclin D1的表达74-75
- 2 结果75-80
- 3 讨论80-81
- 4 参考文献81-83
- 结论83-84
- 综述84-93
- 参考文献88-93
- 致谢93-94
- 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果94-96
- 个人简历96
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 刘俊铎,沈克勤,刘志红,陈惠萍,黎磊石;弥漫增殖型狼疮性肾炎按血管病变为基础的病理分型探讨[J];肾脏病与透析肾移植杂志;1998年03期
2 刘春蓓;胡伟新;谢红浪;章海涛;陈惠萍;曾彩虹;刘志红;黎磊石;;霉酚酸酯与环磷酰胺治疗Ⅳ型伴Ⅴ型狼疮性肾炎的疗效比较[J];肾脏病与透析肾移植杂志;2006年01期
3 胡伟新,黎磊石;重症狼疮性肾炎合并感染和肾衰应用霉酚酸酯治疗[J];肾脏病与透析肾移植杂志;1997年05期
4 陈楠,李晓;狼疮性肾炎的临床特点与病理特征[J];诊断学理论与实践;2004年04期
，本文编号：830925
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