胃癌不同分化层级细胞的分离鉴定及在过继免疫治疗中的应用

发布时间：2017-09-17 07:24

  本文关键词：胃癌不同分化层级细胞的分离鉴定及在过继免疫治疗中的应用

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【摘要】：背景胃癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居恶性肿瘤第二位。常规治疗后复发和转移是胃癌患者死亡的重要原因。因此如何遏制胃癌复发和转移是目前研究的重点,而近年来肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSC)理论的提出为胃癌治疗提供了新的思路。CSC理论认为,只有一小部分肿瘤细胞具有自我更新和无限增殖能力,并由此产生大量相对成熟的常规肿瘤细胞(regular cancer cells, RCC),这些处于肿瘤分化层级顶点的细胞亚群是肿瘤复发和转移的根源。研究人员坚信只有真正消灭CSC,才能根除肿瘤。但到目前为止,仍缺少合适的筛选CSC方法,这也极大的限制了人们对包括胃癌干细胞(gastric cancer stem cells, GCSC)在内的CSC研究。我们知道,正常祖细胞群仍具有一定程度的“干性”,同时也表达干细胞相关标记物。以此类推,肿瘤祖细胞(cancer progenitor cells, CPC)也极有可能具有这种特点。而目前筛选CSC的办法无法排除CPC的存在,因此也有研究用到了CSC/CPC来描述获得的干性细胞群。然而CSC与CPC的生物学特性可能存在着较大差异,这种混杂的细胞群可能无法真实反映出这两个细胞亚群的生物学特性。另一方面,CSC理论是建立在正常组织干细胞理论基础上提出的,即肿瘤组织中应该具有类似正常组织干细胞中由干细胞到祖细胞再到成熟细胞的渐进分化过程。但是目前多数实验仅是将肿瘤细胞群单纯的分为CSC与非CSC,这不足以说明这种分化过程的存在。由此可见,如果能找到合适的方法在肿瘤细胞群中分选出CSC、CPC及RCC,将对深入了解GCSC的生物学特性及完善CSC理论有着重要意义。由于需要在肿瘤干性细胞群中筛选出干性程度高的CSC群与干性程度低的CPC群,因此只有选择与细胞干性密切相关并可区分出强弱表达的标记物才具有可行性。乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)具有这种特性,ALDH是细胞内具有解毒作用的酶类,且在正常干细胞(stem cells, SC)的增殖、分化过程中发挥着重要作用。ALDH作为一种功能性的SC标记物,具有在干细胞中高活性,成熟细胞中低活性或无活性的特点,其活性的高低可以反映出细胞的干性程度。而近年来,已有大量研究人员应用ALDH活性检测方式成功富集了CSC。虽然这些获得的“CSC”仍存在着与CPC混杂的问题,但基于ALDH这种随着细胞“干性”递减而表达量逐步下降的特点或许可以成为筛选肿瘤细胞中不同分化层级细胞亚群的标记物。基于树突状细胞(dendritic cells, DC)的过继免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy, ACI)被认为具有良好的应用前景,以DC荷载抗原诱导成熟的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic t lymphocyte, CTL)更是具有高靶向性高杀伤性肿瘤细胞的优势。同时已有研究发现应用过继免疫治疗靶向CSC会取得更好的疗效。但是在GCSC及胃癌祖细胞(gastric cancer progenitor cells, GCPC)方面的应用未见报道。目的1.利用ALDH活性评估方式分选胃癌细胞中不同分化层级亚群2.探明胃癌细胞中不同分化层级亚群的生物学特性3.明确靶向胃癌细胞中不同分化层级亚群的CTL抑瘤效果方法1.流式细胞技术检测胃癌细胞系MFC中ALDH活性强度：根据检测结果,选取ALDH阳性细胞群中荧光强度最强的细胞亚群作为ALDHhigh群,选取ALDH阳性细胞群中荧光强度最弱的细胞亚群作为ALDHlow群,选取ALDH阴性细胞群中的相对荧光强度最弱的细胞亚群作为ALDHneg群。2.流式细胞技术检测各亚群细胞CD44、CD133表达情况及细胞周期分析。3. RT-PCR技术检测各亚群细胞OCT-4、SOX-2基因的表达情况。4.体外成球实验评估各亚群细胞自我更新能力。5小鼠皮下致瘤实验探究各亚群细胞致瘤能力。6.CCK8法检测各亚群细胞增殖及耐药能力。7.Transwell细胞侵袭实验检测各亚群细胞侵袭能力。8.平板克隆实验检测各亚群细胞克隆能力。9.应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。结果1.ALDH活性表达与MFC细胞干性相关(1)MFC中ALDH阳性细胞群比例占5%±0.91%,我们以ALDH阳性群中荧光强度最强的1%细胞亚群作为ALDHhigh亚群,ALDH阳性群中荧光强度最弱的1%细胞亚群作为ALDHlow亚群,相对无ALDH活性的1%细胞群作为ALDHneg亚群。(2)三群细胞中,CD44比例均大于90%,不适合作为MFC的干性标记物；而随着ALDH活性的降低,CD133比例逐渐下降,分别为(44.07%±3.97%、34.33%±3.06%、1.60%±0.66%),ALDHhigh及ALDHlow表达量明显高于ALDHneg (P 0.01), ALDHhigh比例虽高于ALDHlow,但无统计学差异(P=0.09)。(3)干性基因OCT-4、SOX-2表达也呈现同样的趋势,其中OCT-4在ALDHhig、ALDHlow及ALDH"eg群相对表达量分别为(0.99±0.10；0.43±0.04；0.28±0.03,P0.05)；SOX-2趋势同OCT-4,表达量分别(1.00±0.08；0.63±0.05；0.14±0.03,P0.05)。(4)ALDHhigh及ALDHlow均可在无血清超低粘附条件下形成肿瘤球。相同时间内,ALDHhigh形成的肿瘤球体积明显小于ALDHlow,而ALDHhigh球体内ALDH阳性细胞比例明显大于ALDHlow(70.1%±7.1%VS 30.5%±5.7%,P0.01);ALDHlow细胞亚群在5000/只致瘤条件下致瘤能力强于其他组,而在500/只致瘤条件下,ALDHhigh致瘤能力最强。2.ALDH不同活性细胞亚群生物学特性不同(1)ALDHlow细胞亚群体外增殖能力强于其他组,而ALDHhigh亚群增殖能力最低；(2)S/G2/M期在ALDHhigh、ALDHlow及ALDHneg细胞亚群中比例分别为(40.6%±4.6%；91.1%±1.3%；60.5%±3.4%)组间均有统计学差异(P0.05)；(3)随着ALDH活性下降,各细胞亚群耐药能力逐步下降：(4)ALDHlow细胞亚群形成的克隆数量为(166.3±14.9)明显多于其他组(P0.01),而ALDHhigh细胞亚群克隆数量多于ALDHneg细胞亚群(36.1±6.3；8.0±2.6,P0.05)。(5)ALDHhigh组侵袭能力明显强于其他组(51.7±9.1,P0.05),而ALDHl0W组侵袭细胞数量与ALDHneg组相比,差异无统计学意义(9.7±3.5；11.7±3.6,P=0.895)。3.CTL靶向ALDH各细胞亚群具有不同的抑瘤效果CTL各治疗组小鼠抑瘤率由高到底分别为CTL-ALDHlow、CTL-ALDHhigh CTL-ALDHneg(88.2%±6.3%,68.7%±11.3%；43.2%±29.6%);CTL-ALDHhigh、 CTL-ALDHlow、CTL-ALDHneg及PBS对照组外周血CD31细胞比例分别为(53.4%±2.7%；52.2%±3.8%；52.3%±6.1%；44.1%±3.2%),各治疗组比例均大于PBS对照组,但CTL-ALDHneg组与PBS组相比无统计学意义(P=0.216),各治疗组之间无明显差异。上述组序中外周血CD3+CD8+T细胞比例均高于PBS对照组(24.4%±3.2%;26.3%±1.7%；21.9%±2.5%11.5%±1.8%；P0.01)。组间无明显差异。上述组序中脾脏血的CD3+T细胞比例分别为(20.3%±2.3%；19.06%±1.4%；19.4%±4.7%；10.2%±2.1%),各治疗组比例均大于PBS对照组(P0.05),治疗组间无统计学差异：上述组序中脾脏血的CD3+CD8+T细胞比例分别为(6.7%±2.0%；5.4%±0.9%；5.8%±0.5%；1.8%±0.5%),各治疗组比例均明显高于PBS对照组(P0.05),各治疗组间无统计学差异。结论1.胃癌干性细胞群中存在着生物学特性不同的CSC与CPC, ALDH活性分选可以作为区分CSC与CPC的方法；在干性群中排除CPC是以后提高CSC研究结果可靠度的有效方式。2.CPC与CSC相比,虽然自我更新能力较低,但增殖能力更高,短时间内的危害要高于CSC。3.靶向CPC的CTL治疗方式其抑瘤效果明显强于其他组,CPC可能是未来肿瘤治疗的新靶点。
【关键词】：胃癌 乙醛脱氢酶 肿瘤干细胞 肿瘤祖细胞 过继免疫治疗
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 第一部 胃癌不同分化层级细胞筛选15-38
• (一) 前言15-16
• (二) 材料和方法16-22
• (三) 结果22-26
• (四) 讨论26-29
• (五) 结论29-30
• (六) 参考文献30-38
• 第二部 ALDH不同活性细胞亚群生物学特性分析38-52
• (一) 前言38
• (二) 材料和方法38-42
• (三) 结果42-46
• (四) 讨论46-48
• (五) 结论48-49
• (六) 参考文献49-52
• 第三部 靶向ALDH不同活性细胞亚群免疫治疗的实验研究52-66
• (一) 前言52
• (二) 材料和方法52-57
• (三) 结果57-60
• (四) 讨论60-62
• (五) 结论62-63
• (六) 参考文献63-66
• 总结66-67
• 综述67-96
• 参考文献74-96
• 附录 攻读学位期间发表文章情况96-97
• 致谢97-98

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