槐耳抑制乳腺癌的分子网络构建及53BP1抑癌分子通路研究

发布时间：2017-09-17 08:28

  本文关键词：槐耳抑制乳腺癌的分子网络构建及53BP1抑癌分子通路研究

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【摘要】：研究目的乳腺癌是全世界女性常见的恶性肿瘤之一。随着人们对疾病认识的深入,“乳腺癌是一种全身性疾病”这一论点已被人们广泛接受,在此认识的基础上,乳腺癌的治疗已发展成集手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗及生物靶向治疗及中医药治疗等多种方式于一体的综合治疗体系。中药作为乳腺癌系统性辅助治疗的一部分,在乳腺癌治疗中的应用已引起越来越多的重视。中药的每种组成成分通常具有多种作用,且各组成成分之间又有复杂的相互作用,因此重要通常为多靶点作用方式,具有辨证性及整体性,在癌症治疗的临床应用中有其独到的作用及广泛的应用前景。槐耳是一种具有抗癌作用的中药,其正式问世时是作为原发性肝癌的辅助用药之一,临床应用发现其有明显的抗肝癌作用,但其作用机制尚不完全明确。随后,槐耳开始应用在乳腺癌的辅助治疗中,且在临床应用中也表现出其抗癌性。作为中药的典型代表,槐耳的作用同样具有辨证性和整体性,因此,对其作用机制的研究也必须从全面、整体的角度出发,而不能局限在传统的研究方法中。基因芯片是一种近几十年间迅速发展起来的新兴技术,利用基因芯片技术可以检测数以千计甚至数以万计的基因表达信息。利用基因芯片检测出的基因信息进行深入的数据分析,可以深层次挖掘差异基因所涉及的功能及分子信号转导通路,对下一步的深入研究提供指导帮助。因此,本论文的目的就是利用基因表达谱芯片这一技术,对槐耳抑制乳腺癌的作用机制展开全面检测及分析。利用基因芯片技术,我们将筛选出槐耳作用于乳腺癌细胞所引起的发生显著性变化的功能及分子信号转导通路,揭示槐耳抑制乳腺癌的分子机制,并为后续深入研究提供指导。同时,我们也将定位在槐耳抑制乳腺癌中起到关键作用的基因,并对其功能和作用机制展开深入研究,力求为乳腺癌的新药研发提供新的靶点。研究方法为了研究槐耳抑制乳腺癌细胞的具体作用机制,我们首先用MTT的实验方法检测了槐耳对乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞抑制作用,并根据MTT的实验结果选择适宜的药物作用浓度和作用时间,以刺激乳腺癌细胞。然后,从经槐耳刺激的乳腺癌细胞中提取RNA,进行基因表达谱芯片的检测。从芯片结果中,利用倍数法的方法初步筛选出表达差异基因,并用实时定量PCR的方法对芯片中的部分结果进行验证。然后通过Gene Ontology(GO)分析对表达差异基因参与的生物学功能进行研究,通过Pathway分析对表达差异基因参与的分子信号转导通路进行分析。最后,将GO分析得到的有显著变化的差异基因和Pathway分析得到的差异基因取交集,在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)数据库的指导下,将交集基因绘制成能够直观反映变化的关键基因的基因间相互作用网络图,从而揭示槐耳作用于乳腺癌细胞的多靶点作用方式。在基因芯片结果的提示下,我们通过Western blot和实时定量PCR的方法,对潜在的关键抑癌基因53BP1的表达变化进行了检测。为了拓展研究53BP1的基因功能,我们通过构建载体和细胞转染等方法,筛选出53BP1过表达及干扰的乳腺癌细胞系进行后续研究。我们通过细胞形态观察、Western blot、实时定量PCR和细胞免疫荧光化学等实验方法,检测筛选出的乳腺癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)标志性分子的表达变化。然后,用Transwell的实验方法探究53BP1对乳腺癌细胞系迁移和侵袭能力的影响。为了明确53BP1抑制乳腺癌细胞EMT的具体作用机制,我们采用Western blot和实时定量PCR的方法,对可能的信号通路进行了检测。为明确通路中microRNA (miRNA)的作用,我们向细胞中转染miRNA mimic及miRNA inhibitor,然后用Western blot和Transwell实验来验证miRNA在53BP1抑制乳腺癌细胞EMT过程中的作用机制。在体内实验水平,我们构建了裸鼠皮下成瘤模型,用免疫组织化学的实验方法检测肿瘤组织中EMT关键分子的表达情况,来验证体外实验的结果。最后,我们用实时定量PCR的方法,在临床手术标本组织中检测了53BP1、miRNA和ZEB1等关键分子的表达,来进一步明确我们的实验结果。结果MTT实验结果显示,随着槐耳溶液药物浓度和作用时间的增加,两种乳腺癌细胞的存活数量均越来越少,即槐耳对乳腺癌细胞系的抑制作用呈现出明显的浓度依赖性和时间依赖性。根据MTT的实验结果,我们选择用8mg/mL的槐耳溶液刺激乳腺癌细胞72h,然后进行基因芯片的检测。首先,倍数法初步筛选表达差异基因的结果显示,经槐耳刺激后,MDA-MB-231细胞系中差异基因共有1655个,其中有907个基因表达上升,748个基因表达下降；而MCF-7细胞系中差异基因共有1320个,其中表达上调的有600个,表达下调的有720个。在两种乳腺癌细胞系中,槐耳共同调节的差异基因共有172个,其中98个发生上调,74个发生下调。为了验证基因表达谱芯片结果的可信度,我们用实时定量PCR的方法对结果中的部分基因结果进行了验证,结果显示实时定量PCR的结果与芯片结果基本相符。然后,我们根据芯片结果进行了生物功能学水平的GO分析。结果显示在MDA-MB-231细胞中,共有562个GO功能发生显著差异,其中353个GO功能发生上调,209个GO功能发生下调；而在MCF-7细胞中,共有695个GO功能发生显著差异,其中307个GO功能发生上调,388个GO功能发生下调。两种乳腺癌细胞系受槐耳共同调节的GO功能共有129个,其中77个发生上调,52个发生下调。然后,我们从信号转导通路水平进行了Pathway分析,分析结果显示,在MDA-MB-231细胞中,槐耳显著调节信号通路104条,其中59个通路上调,45个通路发生下调；在MCF-7细胞中,共有77条通路发生了显著变化,其中39条发生上调,38条发生下调。通过将两种细胞系发生显著变化的通路取交集,我们发现,共有36条通路发生变化,其中8条上调,28条下调。最后,我们分别对MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞发生变化的关键基因构建了其分子网络图,并将两种细胞系共同发生变化的分子网络图进行了绘制,最终得出了槐耳调节乳腺癌细胞的重要分子网络。在芯片结果的提示下,我们发现,槐耳作用于乳腺癌细胞后,DNA损伤修复过程中的关键基因53BP1发生了明显上调,这一结果与其它DNA损伤修复通路中的基因变化不符。根据我们的前期研究结果,我们推测在槐耳抑制乳腺癌细胞这一过程中,53BP1发挥了抑癌基因的功能,因此我们对53BP1基因展开了拓展性研究。在对筛选出的过表达和干扰53BP1的乳腺癌细胞的培养中,我们发现细胞的形态发生了明显的变化,这一变化提示53BP1可能抑制了乳腺癌细胞的EMT过程,为了明确这一假设,我们检测了EMT过程中的关键分子,发现53BP1确实能够抑制乳腺癌细胞EMT的发生。同时,我们发现53BP1能够显著抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭能力。为了进一步研究其作用机制,我们检测了EMT转录因子的表达变化,发现ZEB1的表达发生了显著改变,提示53BP1可能通过调节ZEB1从而实现对EMT的抑制作用。miRNA在乳腺癌的EMT过程中发挥重要作用,而ZEB1又是miR-200家族发挥作用的靶基因,因此,我们检测了miR-200家族5个miRNA的表达情况,发现miR-200b和miR-429发生了最为显著的变化。然后我们在高表达：niRNA的细胞中干扰miRNA,在低表达miRNA的细胞中过表达相应的miRNA,发现53BP1所引起的变化均发生了逆转,提示53BP1确实通过调节miR-200b-429/ZEB1/E-cadherin这一信号通路实现对EMT和迁移侵袭能力的抑制。最后,我们从体内实验水平和临床标本水平验证了体外实验的结果。结论1.槐耳对乳腺癌细胞有明显的抑制作用。2.槐耳对乳腺癌的抑制作用呈现多靶点、整体性的特点,涵盖乳腺癌发生发展过程中多个重要生物学功能及分子信号转导通路。3.槐耳能够上调抑癌基因53BP1的表达。4.53BP1能够通过调节miR-200b-429/ZEB1/E-cadherin通路抑制乳腺癌细胞的上皮间质转化和浸润转移。意义1.用基因表达谱芯片的方式,揭示了槐耳对乳腺癌细胞的多靶点作用方式,为槐耳治疗乳腺癌提供基础实验证据,并为今后对槐耳作用机制的研究提供指导方向。2.从槐耳抑制乳腺癌的基因表达谱芯片中筛选出抑癌基因53BP1,为新药开发提供了新的靶点。3.研究了53BP1通过miR-200b-429/ZEB1/E-cadherin通路抑制乳腺癌细胞的上皮间质转化和浸润转移,揭示了抑癌基因53BP1的作用机制。
【关键词】：乳腺癌 槐耳 基因表达谱芯片 53BP1 上皮间质转化
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285
【目录】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-16
• 符号说明16-17
• 前言17-21
• 第一部分 利用基因表达谱芯片分析槐耳分子调控网络的研究21-67
• 材料与方法21-36
• 结果36-65
• 讨论65-67
• 第二部分 槐耳调控53BP1及53BP1抑癌分子通路研究67-98
• 材料与方法67-87
• 结果87-95
• 讨论95-98
• 结论98-99
• 参考文献99-104
• 致谢104-105
• 攻读学位期间发表的学术论文105-107
• 英文论文1107-130
• 英文论文2130-151
• 学位论文评阅及答辩情况151

【参考文献】

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1 李凯;陶京;李_";许州;杨智勇;熊炯p，

本文编号：868361