移植外源性MSCs持久恢复宿主MSCs功能的机制研究

发布时间：2017-09-22 06:20

  本文关键词：移植外源性MSCs持久恢复宿主MSCs功能的机制研究

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【摘要】：【研究背景】近年来,MSCs治疗已被广泛应用到多种人类疾病的治疗中。研究表明,在动物模型以及临床应用中,MSCs治疗可以有效缓解移植物抗宿主病(Gv HD)、风湿性关节炎、炎性肠道疾病、心肌梗死、肝纤维化和多发性硬化症等疾病的症状。我们的前期研究结果也表明MSCs治疗可以有效缓解系统性红斑狼疮(SLE)症状、促进皮肤创伤愈合过程中的血管化、杀伤多发性骨髓瘤、抑制皮肤增生性瘢痕和声带瘢痕。在尝试利用MSCs治疗多种疾病的同时,研究者也在不断地探索MSCs产生疗效的机制。早期研究表明移植的供体MSCs可以在宿主体内存活,并且可以分化为多种成体细胞促进组织再生。随后,越来越多的实验证据表明,在大多数情况下,供体MSCs并不会在宿主体内存在足够长的时间并通过分化过程产生疗效。相反,越来越多的证据表明,MSCs可以通过分泌包括PGE2、TSG-6、VEGF和IL-10等多种可溶性细胞因子调节免疫细胞功能、促进血管化或促进组织再生。同时,也有研究证明供体MSCs可以直接与宿主免疫细胞相互作用并诱导免疫耐受。尽管目前MSCs治疗的一些机制得以阐明,但是很多在MSCs治疗应用过程中观察到的现象尚未得到解释,MSCs产生疗效的机制也尚未得到全面的阐明。其中,非常令人关注的是,在对绝大多数动物疾病模型和病人实施MSCs治疗过程中,MSCs移植通常只进行一次,但是MSCs治疗所产生的疗效却可以持续较长的时间,这些证据表明MSCs治疗可能通过稳定调节宿主细胞的功能产生持久的疗效,也就是产生了疗效的“记忆”。目前,这种MSCs治疗所产生的稳定疗效的机制尚待阐明。表观遗传调控是指在不改变DNA序列的情况下进行的稳定的基因表达调控,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及mi RNA等方式。大量的研究表明,表观遗传调控在疾病的发生发展以及维持疾病性状中起到了重要的作用。同时,利用多种治疗手段通过干预疾病状态下异常的表观遗传状态可以产生持久的疗效。综上所述,我们提出假设:在MSCs治疗过程中,供体MSCs可以通过调节宿主细胞的表观遗传状态产生稳定的治疗效果。在前期研究中我们发现,与系统性红斑狼疮病人相似,系统性红斑狼疮小鼠(MRL/lpr小鼠,含Fas基因突变)具有受损的BMMSCs成骨分化潜能和显著的骨质疏松症状。同时我们发现,单次MSCs治疗可以持久和有效地恢复MRL/lpr小鼠BMMSCs的成骨分化潜能并缓解MRL/lpr小鼠的骨质疏松症状。在本研究中,我们利用MRL/lpr小鼠模型探索MSCs治疗产生持久疗效的分子调控机制。【研究目的】在MRL/lpr小鼠模型中,明确系统注射MSCs所产生的逆转骨质疏松症状并恢复宿主BMMSCs成骨分化功能的持久性疗效,探索表观遗传调控尤其是DNA甲基化修饰在MSCs治疗所产生的持久性疗效中的作用,阐明供体MSCs如何调节宿主BMMSCs的表观遗传学特性。本研究为逆转异常的表观遗传状态提供新的干预手段,并为MSCs治疗的临床应用提供进一步的理论支持。【研究方法】1.MSCs治疗产生的短期和持久疗效。在MRL/lpr小鼠模型中,以系统注射的方式进行MSCs治疗,通过μCT和钙黄绿素双标实验观察MSCs治疗对骨质疏松症状的短期及长期疗效,并通过茜素红染色、Western blot以及裸鼠皮下埋植成骨观察MSCs治疗对MRL/lpr小鼠BMMSCs成骨分化功能恢复的短期及长期疗效。2.MSCs治疗对宿主BMMSCs甲基化状态的调节。通过DNA甲基化芯片分析MSCs治疗前后MRL/lpr小鼠BMMSCs全基因组DNA甲基化模式的变化,观察DNA甲基化抑制剂5-Azacytidine对MSCs治疗效果的抑制作用。3.宿主BMMSCs的Notch信号通路相关基因的甲基化水平及其功能。利用DNA甲基化芯片分析与BMMSCs成骨分化功能相关的Notch信号通路基因的DNA甲基化水平的变化,利用亚硫酸盐测序法对其进行验证,利用Western Blot明确MSCs治疗前后Notch信号通路相关基因的表达,在体外实验和体内实验中观察Notch信号通路的抑制剂DAPT对恢复MRL/lpr小鼠BMMSCs功能的和缓解MRL/lpr小鼠骨质疏松症状的作用。4.Dnmt1对Notch信号通路相关基因甲基化水平的调控。利用Western Blot检测MSCs治疗前后MRL/lpr小鼠BMMSCs中Dnmt1的表达,利用si RNA和茜素红染色观察Dnmt1在小鼠BMMSCs成骨分化中的作用,通过si RNA和过表达质粒分别抑制和过表达Dnmt1,结合DAPT的使用进一步检测Dnmt1通过Notch信号通路调控BMMSCs成骨分化功能。5.mi R-29b对Dnmt1表达水平的调控。利用micro RNA芯片分析筛选MSCs治疗前后恢复表达的micro RNA并利用real-time PCR明确mi R-29b的表达水平,在体内实验中使用inhibitor抑制mi R-29b的表达,并观察其对Dnmt1的表达、对Notch信号通路的调节以及对MRL/lpr小鼠BMMSCs成骨分化功能的恢复和骨质疏松症状的缓解作用,利用mimics过表达mi R-29b,并观察其对Dnmt1的表达、对Notch信号通路的调节以及对BMMSCs成骨分化功能的抑制作用。6.供体MSCs来源的exosome对宿主BMMSCs的mi R-29b水平的调控。利用transwell建立正常小鼠BMMSCs和MRL/lpr小鼠BMMSCs共培养体系,观察共培养对MRL/lpr小鼠BMMSCs功能的恢复作用。通过使用si RNA抑制Rab27a的表达从而抑制exosome的分泌,明确exosome分泌在共培养体系及在MSCs治疗中的作用。系统注射exosome,观察exosome治疗对MRL/lpr小鼠BMMSCs的Dnmt1和Notch信号通路的调节、对其BMMSCs功能的恢复以及对骨质疏松症状的缓解。7.宿主BMMSCs利用供体来源的Fas蛋白控制mi R-29b的分泌。利用si RNA和过表达质粒分别抑制和过表达Fas,观察Fas对mi R-29b分泌的调控作用,分别使用正常小鼠和MRL/lpr小鼠BMMSCs来源exosome和MRL/lpr小鼠BMMSCs共培养,观察不同来源exosome对MRL/lpr小鼠BMMSCs分泌mi R-29b功能的调控,构建Fas-EGFP融合蛋白用以对Fas蛋白示踪,将表达Fas-EGFP融合蛋白的exosome与MRL/lpr小鼠BMMSCs共培养并系统注射,观察免疫荧光染色观察MRL/lpr小鼠BMMSCs中Fas-EGFP融合蛋白的表达。【研究结果】1.MSCs治疗产生了持久的疗效。与正常对照小鼠(C3H/He J小鼠)来源的BMMSCs相比较,MRL/lpr小鼠来源的BMMSCs具有较低的体内和内外成骨分化潜能。同时,与正常对照小鼠相比较,MRL/lpr小鼠具有显著的骨质疏松症状。实施MSCs治疗4星期之后,MSCs治疗显著的恢复了MRL/lpr小鼠BMMSCs受损的成骨分化潜能,并且显著的缓解了MRL/lpr小鼠的骨质疏松症状。更为重要的是,实施MSCs治疗12星期后,MSCs治疗依然保持了对MRL/lpr小鼠BMMSCs成骨分化功能的恢复和骨质疏松的缓解作用。2.MSCs治疗恢复了MRL/lpr小鼠BMMSCs的DNA甲基化状态。MRL/lpr小鼠的BMMSCs具有异常的全基因组DNA甲基化模式和较低的甲基化水平,MSCs治疗以后,这种异常的模式和水平得到了恢复。DNA甲基化抑制剂5-Azacytidine显著抑制了MSCs治疗对MRL/lpr小鼠BMMSCs成骨分化功能的恢复和对骨质疏松症状的缓解。3.MSCs治疗恢复了宿主BMMSCs的Notch通路相关基因的DNA甲基化水平。MRL/lpr小鼠的BMMSCs的Notch通路相关基因具有较低的DNA甲基化水平和较高的表达水平,MSCs治疗恢复了MRL/lpr小鼠BMMSCs的Notch通路相关基因甲基化水平并恢复了Notch信号通路的激活水平。在体内和体外实验中,DAPT显著的恢复了MRL/lpr小鼠的成骨分化能力并显著的缓解了MRL/lpr小鼠的骨质疏松症状。4.Dnmt1调控Notch通路相关基因的DNA甲基化水平。MRL/lpr小鼠的BMMSCs的Dnmt1表达水平较低。在C3H/He J小鼠的BMMSCs中,降低Dnmt1的表达可以降低Notch1甲基化水平,激活Notch通路并抑制BMMSCs的成骨分化。在MRL/lpr小鼠的BMMSCs中,过表达Dnmt1可以恢复MRL/lpr小鼠BMMSCs的Notch1的DNA甲基化水平和Notch通路表达水平,并恢复其成骨分化能力。5.mi R-29b负调控Dnmt1的表达。MRL/lpr小鼠BMMSCs具有高表达的miR-29b水平,MSCs治疗恢复了MRL/lpr小鼠BMMSCs的mi R-29b水平。在体内实验中,抑制mi R-29b的表达可以显著恢复MRL/lpr小鼠BMMSCs的Notch1和Dnmt1表达,恢复其BMMSCs成骨分化能力并缓解其骨质疏松症状。在正常对照小鼠的BMMSCs中,过表达mi R-29b可以抑制Dnmt1表达、降低Notch1基因DNA甲基化水平、激活Notch通路并抑制BMMSCs的成骨分化能力。6.供体MSCs分泌exosome下调宿主BMMSCs的mi R-29b表达。与正常对照小鼠BMMSCs共培养可以恢复MRL/lpr小鼠BMMSCs的mi R-29b、Dnmt1和Notch1的表达水平并恢复其成骨分化能力,抑制正常小鼠BMMSCs的exosome分泌可以削弱这种恢复作用。同时,抑制供体MSCs的exosome分泌显著削弱了MSCs治疗对MRL/lpr小鼠BMMSCs的mi R-29b、Dnmt1和Notch1表达水平的恢复和对其成骨分化能力的恢复。直接注射exosome显著恢复了MRL/lpr小鼠BMMSCs的mi R-29b、Dnmt1和Notch1表达水平、恢复了其成骨分化能力并缓解了MRL/lpr小鼠骨质疏松症状。7.宿主BMMSCs利用供体exosome来源的Fas蛋白释放胞内的mi R-29b。在正常小鼠的BMMSCs中,抑制Fas的表达可以提高胞内mi R-29b的量并抑制mi R-29b的释放;同时,在MRL/lpr小鼠BMMSCs中,过表达Fas可以降低胞内mi R-29b的量并促进mi R-29b的释放。Fas的抑制和过表达不影响mi R-29b的原始转录水平。正常小鼠BMMSCs来源的exosome可恢复MRL/lpr小鼠BMMSCs胞内和分泌mi R-29b的水平,而MRL/lpr小鼠BMMSCs来源的exosome没有此功能。将含有Fas-EGFP融合蛋白的exosome与MRL/lpr小鼠BMMSCs共培养或给予MRL/lpr小鼠系统注射后,均可在MRL/lpr小鼠BMMSCs中观察到融合蛋白的表达。【研究结论】本研究证实,在MRL/lpr小鼠模型中,Fas蛋白功能的缺失导致mi R-29b分泌受阻进而导致mi R-29b胞内水平升高,而高水平的mi R-29b通过抑制Dnmt1的表达降低了Notch通路相关基因的DNA甲基化水平从而激活Notch通路。最终,Notch通路的激活抑制了MRL/lpr小鼠BMMSCs的成骨分化能力并导致了其骨质疏松症状。实施MSCs治疗后,供体MSCs分泌了含有正常功能Fas蛋白的exosome,MRL/lpr小鼠BMMSCs通过exosome利用了供体来源的Fas蛋白促进胞内mi R-29b的释放,进而恢复了Dnmt1和Notch通路相关基因的DNA甲基化水平和表达水平,最终持久性的恢复了MRL/lpr小鼠BMMSCs的成骨分化能力并缓解了其骨质疏松症状。在本研究中,我们通过阐明Fas/mi R-29b/Dnmt1/Notch所组成的表观遗传调控通路,首次揭示了MSCs治疗产生持久疗效的机制,证明了干细胞治疗可以通过表观遗传调控稳定的调节宿主细胞的功能,为逆转疾病发生过程中异常的表观遗传调控提供了新的治疗手段。同时,我们还首次发现,供体细胞来源的细胞成分可以被宿主细胞再次利用,以恢复其自身的功能,提示供体细胞和宿主细胞之间的相互交流在干细胞治疗过程中发挥重要作用。本研究为干细胞治疗的临床应用提供了进一步的理论依据。
【关键词】：MSCs治疗 表观遗传 骨质疏松 miRNA Notch
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R457.7
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-13
• Abstract13-20
• 前言20-21
• 文献回顾21-38
• 第一部分MSCs治疗持久恢复宿主BMMSCs的成骨分化功能38-50
• 1 材料38-40
• 2 方法40-43
• 3 结果43-48
• 4 讨论48-50
• 第二部分MSCs治疗恢复宿主BMMSCs Notch通路相关基因的DNA甲基化水平50-65
• 1 材料50-51
• 2 方法51-53
• 3 结果53-63
• 4 讨论63-65
• 第三部分mi R-29b通过抑制Dnmt1调节Notch通路相关基因的DNA甲基化水平65-80
• 1 材料65-66
• 2 方法66-68
• 3 结果68-78
• 4 讨论78-80
• 第四部分 宿主BMMSCs再利用供体MSCs来源的exosomes中的Fas蛋白调控mi R-29b/Dnmt1/Notch180-101
• 1 材料80-82
• 2 方法82-85
• 3 结果85-99
• 4 讨论99-101
• 小结101-103
• 参考文献103-127
• 个人简历和研究成果127-131
• 致谢131-132

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本文编号：899254