人脐带间充质干细胞移植对脑出血后细胞凋亡的影响

发布时间：2017-09-27 17:37

  本文关键词：人脐带间充质干细胞移植对脑出血后细胞凋亡的影响

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【摘要】：背景脑出血是一种高发病率、高致残率和高病死率的脑血管疾病。在亚洲国家,脑出血占所有卒中的20-30%,其中有30-40%在急性期死亡。脑出血后引起血肿周围脑组织损伤,主要由于血肿的占位效应和直接损伤,其他包括血肿周围组织缺血、继发炎症反应、红细胞溶解产生的血红蛋白所诱导的毒性反应直接破坏周围脑组织,神经元凋亡及等因素引起脑组织水肿、移位和损伤,其中P53,Bcl-2和Bax基因在细胞凋亡中发挥重要作用,从而出现明显的神经功能缺损症状和体征。因此,研究脑出血的治疗非常重要。近年来,脑出血微创清除术受到关注,微创治疗可以在脑出血早期减轻血肿对周围脑组织的压迫,解除占位效应,减少炎症介质,避免直接的化学刺激,从而缓解脑组织继发损伤。但神经元是不可再生细胞,单纯血肿抽吸治疗脑出血,并不能从根本上促进神经功能的恢复。脐带血间充质干细胞(HUC-MSCs)具有多项分化潜能,HUC-MSCs用于脑卒中的治疗实验研究表明,神经生长因子的分泌,减轻炎症反应,减少细胞凋亡等机制促进了神经功能恢复。目的本实验采用微创血肿清除术、微创血肿清除术联合脐带间充质干细胞移植治疗大鼠出血性脑卒中,探讨HUC-MSCs细胞移植对细胞凋亡和对神经功能恢复的影响,探索治疗方案可行性,为急性期临床治疗出血性脑卒中提供实验依据。方法共纳入120只SD大鼠,随机分为4组：(1)对照组(Control组)：用骨钻在颅骨钻孔,于定位穿刺点用微量进样器穿刺右侧尾状核区；(2)脑出血组(ICH组)：麻醉后固定于脑立体定位仪,骨钻定位钻孔,于穿刺点用微量进样器注射Ⅳ型胶原酶入右侧尾状核区；(3)微创血肿清除组(MIS组)脑出血大鼠模型造模成功6小时后,用自制血肿清除装置行微创血肿清除术；(4)细胞移植治疗组(MSC组)脑出血大鼠模型行微创血肿清除术后同部位注入HUC-MSCs悬液。每组大鼠分别于ICH建模后1d、2d、5d、9d、14d和21d处死,每个时间点5只大鼠。脐带取自足月剖宫产健康产妇,分离、培养、分化干细胞,BrdU标记HUC-MSCs。脑出血模型制备成功后6h行微创血肿清除术和HUC-MSCs移植。肝素化生理盐水注入右心耳,大鼠僵化后断头取脑,固定脑组织。脑组织切片以备免疫组织化学染色。检测细胞CD29,CD34,CD44,CD90和CD105的表达,鉴定间充质干细胞。检测P53, Bcl-2和Bax在脑组织的表达,反映细胞凋亡情况。采用SPSS 18.0统计软件包进行统计学分析。检测数据以均值±标准差(x±s)方式表示,P0.05时被认为组间差异有统计学意义。结果经分离培养的HUC-MSCs干细胞,在显微镜下呈长纤维状排列。HUC-MSCs细胞体外分离、培养、免疫细胞化学染色,通过观察,CD44、CD29、CD90、CD105阳性表达,而CD34阴性表达,表明分离培养的细胞符合间充质干细胞的特点,鉴定为HUC-MSCs干细胞。共计120只脑出血模型大鼠Bederson评分大于2分,建模成功。大鼠移植血肿部位接受BrdU标记的HUC-MSCs细胞移植后,采用免疫组织化学的方法进行研究,发现在1d到21d均可见到BrdU染色阳性的细胞,并且在血肿周围组织、颞叶海马区及大脑皮质区有染色阳性细胞,而Control组、ICH组和MIS组脑组织内免疫组化未显示阳性细胞,表明在细胞移植后,HUC-MSCs细胞能够成活并迁徙到血肿附近及远隔组织。ICH组、MIS组和MSC组在每个时间点mNSS评分均显著低于control组(P0.05)；从2d开始,MIS组和MSC组在每个时间点mNSS评分均显著低于ICH组(P0.05)；MSC组较MIS组在5d、9d、14d和21d评分低(P0.05)。脑组织免疫组化结果显示,脑出血后3个干预组与对照组相比,在每个时间点P53表达阳性数均有明显差别(P0.05)；MSC组在1d、2 d时与MIS组之间无统计学差异,MSC组在5d、9d、14d和21d时P53阳性表达低于MIS组(P0.05),在2d、5d、9d、14d和21 d时,MIS组P53阳性表达低于ICH组(P0.05)。与对照组相比,从术后5d开始,ICH组、MIS组和MSC组在每个时间点Bcl-2表达阳性率均有明显增强(P0.05)；MSC组在9d、14d和21d时Bcl-2阳性表达明显高于MIS组(P0.05)；MIS组Bcl-2阳性表达在5d、9d、14d和21d时高于ICH组。MSC组在5d、9d、14d和21d时阳性表达低于MIS组(P0.05),在2d、5d、9d、14d和21d时,MIS组Bax阳性表达低于ICH组(P0.05)。脑出血后P53和Bax的表达在1d达高峰,第5d表达逐渐减少。Bcl-2的表达在2d时达高峰,第5d维持在高表达状态,随后表达逐渐减少。结论脑出血导致血肿周围脑组织凋亡相关基因的表达。细胞移植后,HUC-MSCs细胞可以在血肿周围存活并迁移到远隔组织。P53、Bax、Bcl-2表达主要集中于血肿周围组织、皮质、皮质下和海马区的胞浆内。微创血肿清除和微创术后HUC-MSCs细胞移植都增加血肿周围脑组织Bcl-2表达,降低P53、Bax阳性表达。微创术后HUC-MSCs细胞移植比单纯血肿清除术期更有效的降低细胞凋亡。血肿清除及人脐带血间充质干细胞移植有效降低P53及Bax表达,提高Bcl-2表达阳性率,血肿清除后行人脐带血间充质干细胞移植对减少细胞凋亡,促进神经功能的恢复更有效。本实验为临床治疗脑出血提供依据,需要更深入研究证实。
【关键词】：脐带间充质干细胞 微创血肿清除术 脑出血
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.34
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-14
• 前言14-17
• 材料与方法17-24
• 结果24-27
• 讨论27-37
• 结论37-38
• 附图38-41
• 附表41-45
• 参考文献45-50
• 致谢50-51
• 攻读学位期间发表的论文51-52
• 学位论文评阅及答辩情况表52-53
• 外文论文53-121

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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3 侯克东;卢世璧;张莉;袁玫;孙明学;彭江;赵斌;眭翔;许文静;;人脐带Wharton胶中间充质干细胞的分离、培养与鉴定[J];解放军医学杂志;2008年04期

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本文编号：931050