RhoC调控人滋养细胞迁移的机制及子痫前期患者临床资料分析

发布时间：2017-09-29 21:16

  本文关键词：RhoC调控人滋养细胞迁移的机制及子痫前期患者临床资料分析

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【摘要】：背景与目的子痫前期(preeclampsia,PE)/子痫(eclampsia)一直是严重影响孕产妇和围产儿健康的产科重症,其发病率和致死率均较高,但其发病原因尚不明确,因此临床治疗多以“对症治疗”和“适时终止妊娠”为主要手段,效果不佳。根据近些年来形成的且被广泛接受的“两阶段学说”理论,在早孕期胎盘的滋养细胞侵袭障碍是PE发生的起始因素,而中晚孕期胎盘源性的致病因子释放进入母血中造成孕妇广泛性的内皮损伤和全身的系统性免疫-炎症反应是PE发生的中心环节。同时,滋养细胞侵袭性迁移的不足造成的胎盘形成不良还可能导致流产和胎儿宫内生长受限,相反,若侵袭性迁移过度则可能引发葡萄胎、绒毛膜癌以及胎盘植入。因此阐明人类滋养细胞侵袭性迁移的内在机制和调节因素成为解决这些疾病困扰的关键。滋养细胞的侵袭性迁移是一个涉及“细胞形态极化→细胞前缘伪足形成→细胞与靶方向上的胞外基质粘连→细胞尾部撤离原位→粘连结构分解→胞体收缩前移”等多个环节的细胞生物学过程,并受到众多细胞内外因素的精确调节,其内在的分子机制也未明确。但已有证据显示在细胞动态迁移的过程中,细胞骨架的聚合和粘连结构的解离贯穿于其中,成为细胞侵袭性迁移的动力基础和前提条件,同时也是调控和干预滋养细胞迁移的关键靶点。本课题组成员在前期实验中发现,小G蛋白中的Rho亚家族蛋白成员RhoA和Rho C在人滋养细胞固有迁移和诱导性迁移中均能发挥分子开关作用,其中RhoA主要是通过干扰微丝骨架的有序重组实现的,而Rho C对滋养细胞迁移的调控则依赖于微丝以外的其他未明机制。已有研究表明,Rho C与体细胞迁移,特别是肿瘤细胞的远处转移关系密切,且该分子在进化上晚于RhoA,对细胞凋亡、物质和能量代谢等细胞的基础生命活动几乎不存在影响,因此,具有良好的药物开发和应用前景,但Rho C对人滋养细胞迁移中的调控机制有待证明。既往研究显示,RhoC主要是通过其下游的Rho相关卷曲-螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiledcoil forming protein kinase,ROCK)发挥调控作用,而且Rho C激活后细胞的内微管骨架结构可能发生了变化,而微管又可以与细胞的重要粘连结构黏着斑发生相互作用,影响细胞的黏附和迁移,但作用模式和信号通路未见报道。结合细胞微管骨架稳定性的调节机制,我们推测微管结合蛋白4(microtubule-associatedprotein4,map4)可能是rock影响滋养细胞微管聚合的关键分子,但作用机制不清。因此,本研究在细胞实验部分着重对rhoc/rock调控人滋养细胞迁移相关的微管骨架和黏着斑结构方面的可能机制进行初步探讨。然而,由于目前临床对于pe的治疗措施十分有限,针对早孕期发病先导因素的靶向治疗研究尚需要较漫长的研发过程,而pe的较高发病率和不良妊娠结局对疾病的早期预测和防治提出了更为紧迫和现实的要求。根据pe发病的“两阶段学说”理论,pe患者胎盘释放大量的不良作用因子(包括il-2、tnf-α、sflt-1等炎性因子和合体滋养细胞微泡等)进入母体血循环,导致患者体内发生严重的系统性免疫-炎症反应,凝血-纤溶系统受到严重的影响,其凝血指标和血小板参数对于预测pe意义重大。既往的许多临床研究由于纳入患者的妊娠合并症和并发症干扰,结论往往不确定,甚至完全相反。因此,本研究在临床资料分析部分严格制定pe患者的纳入标准,并对其凝血指标和血小板参数的变化趋势及其对pe的预测价值进行初步探讨。此外,在“两阶段学说”理论中,pe患者孕晚期从胎盘释放的致病因子(炎性因子和合体滋养细胞微泡等)可导致母体的多器官损害,大量的临床证据均显示肾脏是其中受损较早、程度较重的器官。因此,本研究在临床资料分析部分还回顾了pe/子痫患者产前或产后1周内的肾活检的病理学特征和母儿情况。材料与方法在细胞学实验部分,本研究以人滋养细胞jeg-3细胞系为主要研究平台,分别构建rhoc蛋白的高表达和低表达慢病毒载体,并用相应的慢病毒包装感染jeg-3细胞,在体外实现对人滋养细胞rhoc基因的调控;然后分别利用transwell小室迁移实验和划痕实验检测不同rhoc表达水平的滋养细胞固有迁移和水平迁移的能力变化,利用transwell小室结合基质胶的侵袭实验检测滋养细胞中不同rhoc蛋白表达水平对细胞侵袭功能的影响,利用cck-8细胞增殖实验检测在正常培养和低血清培养条件下滋养细胞中rhoc表达变化对于细胞增殖的作用;再采用免疫印迹法检测rhoc高表达和低表达细胞中rhoc下游靶分子rocki和rockii蛋白的表达,以及调节微管聚合的map4蛋白的表达差异;为了分析不同rhoc表达水平的滋养细胞中微管的聚合和解聚水平,我们先将细胞中聚合状态和游离状态的微管蛋白进行分离,再用的免疫印迹分别进行蛋白水平检测,同时还在激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞微管结构的变化情况;最后运用免疫印迹法检测不同rhoc表达水平的jeg-3细胞中黏着斑蛋白的表达情况,并用激光共聚焦显微镜扫描细胞中黏着斑结构的排列特征。在pe患者临床资料分析的第一部分中,本研究首先选取2007年1月至2013年12月间在第三军医大学大坪医院产科住院分娩的孕妇共173人,其中轻度子痫前期(mildpreeclampsia,mpe)患者53人,重度子痫前期(severepreeclampsia,spe)患者42人,正常对照组孕妇79人。重点排除了既往有肾病史、胰岛素依赖型糖尿病、需要甾体激素治疗的哮喘、慢性肝炎(无论是否有肝功能异常)、严重的外伤史、服用抗凝药物史、口服避孕药物史、吸烟史、特发性血小板减少性紫癜、hellp综合征、妊娠期血小板减少症或任何类型的血液系统疾病的患者。分别收集每名患者早孕期和晚孕期凝血功能和血小板参数的检测结果,再对其进行对比和统计学分析。不同组别之间的正态分布变量差异的显著性采用单因素方差分析多重比较,对于非参数变量则采用kruskal-wallis法检验并进行post-hoc分析。比较同一患者不同孕期的相同参数使用配对检验,其中正态分布变量采用fisher'slsd法,而非参变量采用wilcoxon法。最后采用使用受试者工作特征(receiver-operatingcharacteristic,roc)曲线评估每一项参数预测pe发病和严重程度的实际效能,并利用二进制回归分析评价筛选出的指标对pe的预测价值。在pe患者临床资料分析的第二部分中,本研究回顾了从2007年1月至2012年1月间,因病情进展或诊治需要于妊娠期或分娩后7日内在第三军医大学大坪医院肾脏内科进行超声引导下的细针经皮肾穿刺活检的spe/子痫患者,共8例。所有患者均排除了糖尿病史、系统性红斑狼疮病史、慢性高血压病史、肾病病史或近期出现的尿路感染。对这些患者的临床特点、母儿结局、母体主要血清学指标,并重点观察和分析了其肾脏病理切片和免疫荧光特征。主要结果:(一)细胞学实验部分1.本研究利用生物信息学技术、rna干扰技术结合基因工程技术成功构建了rhoc高表达和rhoc干扰慢病毒载体,并利用这两种慢病毒的包装成功高效感染293t细胞模型和jeg-3滋养细胞,并鉴定和筛选出rhoc持续高表达和持续低表达的稳定转染jeg-3滋养细胞株,其rhoc蛋白表达水平分别显著高于和低于空载体病毒感染组的滋养细胞和正常对照组滋养细胞。2.在正常细胞培养的条件下,滋养细胞中rhoc蛋白表达水平升高可显著提高细胞的固有迁移、水平迁移、侵袭和增殖能力,而rhoc蛋白表达降低则可显著抑制细胞的固有迁移、水平迁移、侵袭和增殖的能力;但在低血清培养条件下,滋养细胞中rhoc的表达水平并不会对细胞增殖造成显著影响。3.在滋养细胞中,rhoc下游的靶分子rocki和rockii的蛋白表达水平与rhoc蛋白表达高度一致,提示rhoc在细胞内可能通过促进rocki和rockii分子的表达和作用而发挥生物学效应;而在滋养细胞中,map4蛋白的表达与rocki和rockii的变化高度一致,提示rhoc可能通过rocki和rockii对map4的磷酸化而实现对细胞迁移的调控。4.在滋养细胞中,rhoc蛋白可以对微管的聚合状态和游离状态进行调节,rhoc表达升高后聚合状态微管蛋白显著增多而游离状态微管蛋白显著减少,微管的结构在形态学上聚合增强,排列有序;rhoc表达降低后胞内游离状态的微管蛋白水平上调而聚合状态的微管蛋白水平下调,微管结构在形态学上趋于解聚,排列紊乱。5.在滋养细胞中,rhoc蛋白表达与黏着斑蛋白的水平变化相反,rhoc上调后黏着斑蛋白表达降低,在形态学上黏着斑的结构解离增强;rhoc下调后黏着斑蛋白表达升高,在形态学上黏着斑结构的重构增强。(二)pe患者临床资料分析一1.正常孕妇晚孕期活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime,aptt)、凝血酶原时间和凝血酶时间(thrombintime,tt)水平较早孕期降低,而纤维蛋白原(fibrinogen,fib)水平升高,表现出生理性的高凝状态;晚孕期血小板计数(plateletcount,ptcount)水平较早孕期下降而mpv升高,可能是由血小板聚集和消耗以及继发性血小板再生所引起。2.pe患者在孕晚期出现了超高凝的状态,其微血管中微血栓的形成和纤维蛋白的大量产生及继发性溶解导致血小板和fib的大量消耗,pe特别是spe患者孕晚期出现aptt和tt延长以及d-二聚体和平均血小板体积(meanplateletvolume,mpv)的升高,提示其体内发生了内源性和外源性凝血途径的严重紊乱。3.mpv是早期预测pe的理想指标(以mpv8.95fl为入选标准),也是预测pe严重程度的重要潜在标志(以mpv9.95fl为入选标准)。(三)pe患者临床资料分析二1.pe/子痫患者肾脏活检常见的病理特征包括:内皮增生、足细胞空泡形成、肾小球系膜细胞增殖和肾小管管腔的蛋白管型;2.补体成分(c4)和免疫球蛋白(igm)的沉积,可能导致严重的肾损伤;3.bun/scr比值有成为spe标志物的潜力;4.子痫可以发生于血压稍高于正常范围(135/93mmhg)的患者,在临床工作中必须引起高度的重视;5.妊娠期间的肾活检仅推荐用于确诊和改进治疗策略,并应根据患者的一般条件,包括血压和凝血功能等情况酌情实施。结论:(1)Rho C对滋养细胞的固有迁移、水平迁移和侵袭能力具有调控作用,其主要机制是通过激活下游靶蛋白ROCK I和ROCK II来调节MAP4分子的表达,进而影响细胞微管骨架的聚合和黏着斑结构的重构。这些结果为深入阐明Rho亚家族蛋白调控滋养细胞迁移的细胞骨架相关机制奠定了一定的研究基础,也为开发新的滋养细胞迁移调控靶点进而对PE的发生进行早期预防提供了初步的实验依据。(2)正常妊娠晚期孕妇凝血-纤溶系统处于生理性的高凝状态,表现为血小板数量的消耗和生成的激活;PE患者的内源性和外源性凝血途径均发生严重紊乱而出现超高凝的状态,同时消耗了血小板和纤维蛋白原,造成患者多器官病变和出血倾向,导致PE发病或进一步加重病情;MPV可作为PE发病和严重程度的早期预测指标。这些结果为PE的凝血特点研究及早期预测研究奠定了初步的基础。(3)内皮增生、足细胞空泡变性、肾小球系膜细胞增殖和肾小管腔的蛋白管型是PE/子痫患者肾活检的主要病理表现,C4和Ig M的沉积可能是PE患者肾脏损伤和蛋白尿的重要原因。这些结果为深入研究PE患者器官损害及其机制提供一定的临床资料。
【关键词】：Rho C蛋白 慢病毒载体 RNA干扰 人滋养细胞 迁移 侵袭 微管 ROCK蛋白 微管结合蛋白4 黏着斑 子痫前期 子痫 凝血功能 血小板 平均血小板体积 肾脏活检
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.244
【目录】：

• 缩略语表5-8
• 英文摘要8-16
• 中文摘要16-21
• 第一章 前言21-25
• 第二章 RhoC在人滋养细胞迁移中的作用25-61
• 2.1 材料与方法25-43
• 2.2 结果43-55
• 2.3 讨论55-60
• 2.4 小结60-61
• 第三章 RhoC调控人滋养细胞迁移的机制61-77
• 3.1 材料与方法61-64
• 3.2 结果64-72
• 3.3 讨论72-76
• 3.4 小结76-77
• 第四章 子痫前期患者凝血指标和血小板参数的特点及其对疾病预测的价值77-91
• 4.1 材料和方法78-79
• 4.2 结果79-86
• 4.3 讨论86-89
• 4.4 小结89-91
• 第五章 子痫前期及子痫患者肾活检的临床和病理特点91-109
• 5.1 材料与方法91-94
• 5.2 结果94-102
• 5.3 讨论102-107
• 5.4 小结107-109
• 全文结论109-111
• 参考文献111-128
• 文献综述一 Rho GTP酶调控细胞迁移研究的新进展128-141
• 参考文献135-141
• 文献综述二 子痫前期早期筛查和风险预测研究的新进展141-153
• 参考文献149-153
• 攻读博士期间发表的论文153-155
• 攻读博士期间获得的项目资助155-156
• 致谢156-157

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李力;;子痫前期研究现状与思考[J];中国计划生育和妇产科;2014年01期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 熊钰;出凝血功能改变在子痫前期发病机制中的作用[D];复旦大学;2008年

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本文编号：944257