登革病毒全基因序列的时空特点和登革热以及重症登革的病原学诊断、临床特点和预后预测分析

发布时间：2017-09-28 18:21

  本文关键词：登革病毒全基因序列的时空特点和登革热以及重症登革的病原学诊断、临床特点和预后预测分析

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【摘要】：登革热(Dengue fever, DF)是由登革病毒(Dengue virus, DENV)感染引起的一种急性的媒介传染病,该病毒感染宿主后其临床表现各异,可以表现为无症状、轻型的流感样综合征,也可以表现为重症登革热(Severe dengue disease,SD),即登革出血热(Dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合症(Dengue shock symptom、DSS)。登革病毒是有包膜的单股正链RNA病毒,由11000个核苷酸组成。其基因组编码成一个多肽链后,在宿主的信号肽酶及病毒编码的蛋白酶作用下,裂解成三种结构蛋白(衣壳蛋白C、膜蛋白及其前体M/prM和包膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。 DENV分为4种血清型：DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。该病主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,流行于热带及亚热带地区,尤其是在亚洲、太平洋群岛及中、南美洲国家已构成严重的威胁。据估计2010年感染登革病毒的人群约有3.9亿,其中显性感染为0.96亿,隐性感染达到2.94亿。目前,尚无有效的抗病毒药物和疫苗用于临床。同时伴随着世界社会和经济效益的影响,登革热传播地理范围逐渐增广、感染人数逐渐增加和疾病的负担逐渐加重,因此其已经成为严重的公共卫生问题之一。我国大陆自1978年广东省佛山市首次暴发登革热疫情以来,登革热在我国已经流行了37年。已经报道流行的地区有海南、广西、福建、浙江和云南省,2013年河南省也报道了登革热的暴发。2014年广东省暴发了自1986年以来最大的一次登革热疫情,共有44894例患者,死亡6例。四种血清型的登革热病毒在我国大陆都有流行过。1979年和1985年广东省流行的登革病毒为DENV-1,而且1991年和1995年至2014年登革热的流行和散发也是由DENV-1感染导致的；1985年海南省、1988年的广西省、1993年、1998年和2001年广东省、1999年福建省暴发的登革热是由DENV-2感染导致；1982年以来我国大陆就很少有DENV-3的流行,而DENV-4为散发病例,常伴随其他登革病毒的血清型共同流行。目前,最广为接受的登革热的基因分型使用的基因区域是E基因区域。虽然登革热在我国国大陆流行以来,有研究使用登革病毒E基因区域分析其分子和进化的特征,但是尚无研究评估登革病毒的各个基因区域是否适合用于登革病毒的分子流行病学特征的分析。所以需要分析我国大陆流行的登革病毒的分子流行病学特征,即评估登革病毒各个基因区域能否准确反应登革病毒全基因的特征和登革病毒的时空特点。感染登革病毒后,疾病谱较为宽广,可以是无症状,或是重症,甚至可能威胁生命。世界卫生组织登革热指南中确诊登革病毒感染的方法有：登革病毒的分离和鉴定、病毒核酸检测和血清中抗体检测(IgM/IgG)检测。但是这些方法都存在局限性,例如需要急性期患者的血清(感染登革病毒0-5天)、病毒的分离和确定需要较长时间(1周)、检测结果的假阳性和假阴性,以及血清学检测需要恢复期患者的血清进一步确诊。所以需要一种经济费用较低、省时和方便的实验室检测方法来确诊登革病毒的感染。自从使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测到登革病毒的非结构蛋白1(NS1)后,学者们发现NS1蛋白有两个存在形式：膜性和可溶性,并且都是非常保守的。据报道无论是首次感染还是二次感染登革病毒,登革热患者在发病的急性期(O到6天)就能够检测到血清中的NSl蛋白,并且登革热发病后9-18天,仍能在患者的外周血中检测到。这为确诊登革热提供了较为广泛的时间窗口。目前主要有两种技术手段检测登革病毒的NSl蛋白：一种是酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent assay, ELISA),另外一种是免疫层析法(Immunochromatography assay, IA)。根据这两种技术原理,也开发出了相应的捕获登革病毒NS1蛋白商用试剂盒。在大多数的临床研究中,也表明这两种方法诊断登革热的敏感性和特异性较好,所以需要与传统实验室检测方法(登革病毒的分离和鉴定、病毒核酸检测和血清中抗体检测(IgM/IgG)检测)相比,系统性的评价这两种技术在确诊登革热中的作用。2009年世界卫生组织(WHO)将登革热分类为登革热和重症登革热,包括了一系列的“预警指征”旨在帮助临床医生预测有可能进展为重症登革热的患者。因为登革热患者预警指征帮助临床医生早期识别患者的疾病转归,并决定患者的管理和治疗。早期出现登革热轻型临床表现的患者可以通过传统的实验室检测病毒或特异性的抗体来确诊登革热病毒的感染,但是对于重症登革热患者难以确诊,因为其临床表现相对出现在疾病的晚期,常常是患者血液中已经检测不到病毒和特异性的抗体,也缺乏其他特异性的实验室检测指标。然而,由于有较好的临床支持治疗和护理,重症登革热的死亡率是可以不超过1%。因此,很多学者的研究集中到能确定患者疾病进展的高风险因素。WHO的指南将非重症登革热分为两类：一类是登革热伴有腹痛、粘膜出血和肝肿大等预警指征,另外一类是不伴有预警指征的登革热,而登革热伴有预警指征的患者提示需要重症监护、疾病更严重,甚至是与死亡相关,所以临床表现仍是早期预测的指标。虽然有报道登革热的其他的临床症状,如恶心、呕吐、腹痛、皮疹和出血等临床症状也与重症登革热有关,但是这些关系仍未阐明。临床上登革热患者出血的症状表现各异,例如皮肤瘀斑、束臂试验、牙龈出血、胃肠道出血等。原先诊断登革出血热的标准之一：束臂试验,也有研究已经表明不能区分登革热和登革热出血热。基于以上研究之间存在着争议,需要对既往研究进行系统的评价,确定早期预测重症登革热的临床症状和体征,以降低重症登革热的死亡率。血液学的参数也常常被认为是潜在的预测因子,最常用的指标是血小板计数。但是血小板减少症与出血的相关性不佳,只有一项研究中证实低血小板计数与血管渗漏的严重程度相关。登革热患者的肝脏损害也是常见症状之一,各种程度的感染都能导致转氨酶的升高。患者的肝脏损害越严重,疾病的临床表现就越严重。在疾病的极期,低蛋白血症与血管渗漏也存在很好的相关性。最新一项系统性评价结果表明凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶原时间(APTT)的延长与登革休克综合征是显著相关的。然而这些这些研究结果主要来自亚洲和拉丁美洲,缺少我国大陆的相关数据。2014年我国广东省出现了自1978年以来暴发规模较大的一次流行,截止到2014年12月1日,共有共有44894例登革热患者。所以需要研究我国登革热患者的数据,从临床症状、体征和血液学参数分析重症登革热的预测因素。第一部分我国大陆登革病毒全基因的时空分析研究方法从NCBI的GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下载我国大陆1978年至2011年登革病毒全长基因序列,并同时下载国际公认标准株序列,即：登革病毒Ⅰ型夏威夷株(DENV-1, Hawaii株)、登革病毒Ⅱ型新几内亚株(DENV-2, New guinea-C株)、登革病毒Ⅲ型H87株(DENV-3, H-87株)和登革病毒Ⅳ型H241株(DENV-4, H241株)。将DENV-1和DENV-2病毒的基因序列装载到Mega5.05软件中进行多序列比对,比对完成后构建系统进化树和基因的遗传进化距离。对四种血清型的氨基酸变异分析,使用统计软件SPSS13.0软件。计量资料采用均数±标准差(x±S)。对于符合参数检验的多组之间采用One-Way ANOVA(检验统计量：F),两组间采用Student-t Test(检验统计量：t)；对于不符合参数检验的多组之间采用非参数检验：Kruskal-Wallis检验(检验统计量：x2)、Mann-Whitney U检验(检验统计量：Z),取双侧P0.05为有统计学差异。研究结果1.共纳入分析登革病毒40株,其中DENV-1为19株,DENV-2为11株,DENV-3为6株,DENV-4为4株。DENV-1和DENV-2的14个基因区域与全基因构建的进化树不完全相似,并且各个基因的遗传进化距离变异较大。2.根据登革病毒的四种血清型分为四组：DENV-1氨基酸突变个数为85.211±13.252个；DENV-2为72.727±21.448个；DENV-3为59.167±22.649个；DENV-4为82±18.129个。统计分析结果显示四种血清型的登革病毒之间的氨基酸变异个数具有显著性统计学差异(F=5.661,p=0.003),进一步的多重比较选LSD法,DENV-1与DENV-2和DENV-3氨基酸变异数存在显著性差异(p=0.002和p=0.003),其余组之间无显著性差异,说明DENV-1的氨基酸变异个数最多。3.根据登革病毒的分离时间和血清型分为四组：1991年至2000年的DENV-1,共5株,开放阅读框的氨基酸变异个数82±6.7个；2001年至2010年的DENV-1,共12株,氨基酸变异个数为89.2±14.2个；1991年至2000年的DENV-2,共4株,氨基酸变异个数为74.8±7.8个；2001年至2010年的DENV-2,共4株,氨基酸变异个数为70.0±5.7个。统计分析结果显示四组之间的氨基酸变异个数具有显著性统计学差异(F=3.671,p=0.029)；进一步研究发现以2000年以后流行的DENV-1和DENV-2病毒株的E基因区域(非参数检验：Mann-Whitney U法)和NSl基因区域(参数检验：Students-t法)的氨基酸变异个数存在显著性统计学差异(E基因区域：Z=2.961,p=0.003; NS1基因区域：t=4.896,p0.001)。4.进一步分析发现在DENV-1病毒株的E基因区域出现N290D, L402F和A473T的突变,在NS1区域中出现R101K、G105R、D340E和L349M的突变,而这些突变位点在DENV-2病毒株中未出现。5.根据登革病毒流行的地点分为两组：流行于广州地区的DENV-1共14株,NS3的氨基酸变异个数为12.1±2.0个；非广州地区的DENV-1共5株,NS3基因区域的氨基酸变异个数为9.8±1.8个。流行于广州地区的DENV-1病毒株,其NS3区氨基酸变异数高于非广州地区,差异有统计学显著性意义(t=2.3,p=0.034)；广州地区的DENV-2共4株,NS3基因区域的氨基酸变异个数为12.8±1.5个,非广州地区的DENV-2共7株,NS3基因区域的氨基酸变异个数为8.4±4.5个,流行于广州地区的DENV-2病毒株,其NS3区的氨基酸变异数高于非广州地区,差异有统计学显著性意义(Z=2.2,p=0.042)第二部分NS1蛋白捕获法诊断登革热的系统评价研究方法制定文献纳入标准,需要实验室确诊为登革病毒感染,以下三种方法之一即病毒的分离和鉴定、病毒RNA检测和IgM和/或IgG血清学转换的血清学的检测,同时报道有NS1检测结果；纳入研究的登革病毒感染人群和对照人群的样本量,每组至少50例。检索数据库NCBI PubMed、ISI Web of Science、Google学术和中国学术期刊全文数据库(the Chinese National Knowledge Infrastructure databases, CNKI),检索的时间设定均从建库到2012年10月。检索词以"dengue"、“NS1”或"non-structure 1"、"diagnosis"主题词进行布尔逻辑搭配检索。提取数据,评价纳入研究的文献质量,并使用STATA 11.0软件进行数据分析。研究结果共纳入18篇观察性研究,12313患者。单用NS1检测法,分为两种,即酶联免疫吸附法(Panbio Dengue Early ELISA Kit,Dengue NS1 Ag ELISA Kit和Platelia Dengue NS1 Ag-ELISA Kit)和免疫层析法(Dengue NS1 Ag STRIP Kit和SDBIOLINE Dengue Duo Strip Kit),其合并后的敏感性为67%(95%CI为59-74%)和99%(95%CI为97-99%),特异性为71%(95% CI为61-79%)和99%(95%CI为98-100%),诊断风险比(DOR)为148(95% CI为51-429)和328(95% CI为103-1046),以及受试者工作曲线下面积(HSROCs)为0.92和0.96。对于NS1联合IgM检测,合并后的敏感性、特异性、DOR和HSROC分别为83%(95% CI68-92%)、86%(95% CI 79-91%)、31(14-70)和0.91(95% CI0.89-0.93)。登革热病毒血清分型：DENV-1为50%-90.9%之间,DENV-2为38.5-85.7%,DENV-3为46.7-91.3%和DENV-4为21.7-87%。第三部分临床症状和体征预测重症登革热的系统评价研究方法制定文献纳入标准,符合登革热诊断标准,不限纳入研究的类型,可以是观察性研究,明确将患者分为登革热和重症登革热(登革出血热或登革休克综合征),并能分别获得各组患者临床症状和体征的信息。排除重复使用的样本的研究和信息不足的研究。检索数据库NCBI PubMed、Armed Forces Pest Management Board Literature Retrieval System和Googl学术。检索的时间设定均从建库到2000年1月至2012年8月。检索词以"dengue fever"、"DF"、"dengue haemorrhagic fever"、"DHF"、"dengue shock syndrome"、"DSS"和"clinical"主题词进行布尔逻辑搭配检索。提取数据,评价纳入研究的文献质量,并使用STATA11.0软件进行数据分析。研究结果16篇研究纳入分析,共纳入分析11个因素,分别为：性别、恶心/呕吐、出血(牙龈出血、鼻出血、呕血和黑便)、头痛、腹痛、眶后痛、皮疹、腹泻、肝肿大、乏力和束臂试验。其中5个因素是增加重症登革热发生的危险因素,即出血(OR:13.617,95% CI:3.281-56.508)、恶心/呕吐(OR:1.692,95% CI1.256-2.280)、腹痛(OR:2.278,95% CI:1.631-3.182)、皮疹(OR:2.031, 95% CI:1.269-3.250)和肝肿大(OR:4.751,95% CI:1.769-12.570)。在出血的四种相关的症状重,只有呕血(OR:6.174,95% CI:2.66-14.334, P 0.001)和黑便(OR:10.351,95% CI:3.065-34.956, P 0.001)可显著增加重症登革热的发生,其余则不增加重症登革的发生,而头痛(OR:0.555,95% CI: 0.455-0.676)则可以减少重症登革热发生。第四部分2014年广东省212例登革热的临床特征分析研究方法纳入2014年6月至10月在南方医科大学南方医院和广州市第八人民医院住院的登革热患者回顾性分析,入选标准患者符合2009年WHO发布的登革热诊疗指南的诊断标准。采用SPSS13.0软件进行统计分析,对于符合参数检验的计量资料采用均数±标准差(x±S)表示,组间比较采用t检验(Student's t test);不符合参数检验的计量资料采用中位数和极大值、极小值表示,组间比较采用非参数检验(Kruskal-Wallis test)。采用MedCalc软件绘制受试者工作特征曲线(ReceiverOperating Characteristic Curve,ROC曲线),并统计ROC曲线下面积(Area Under the ROC, AUC),以及临界值。二分类的Logistic回归用于分析预测重症登革热的因素。P值取双侧,且P0.05有统计学意义。研究结果共纳入212例住院患者,平均年龄为40.6±16.0岁,男性102例,女性110例,登革热组患者为174例,重症登革热组患者38例。两组患者在性别上存在显著性差异(p=0.003),重症登革热患者女性较多。两组患者的临床表现中,重症登革热患者中出现意识障碍、嗜睡、黄疸、胸腔积液、腹水、HCT升高超过20%伴血小板快速降低和阴道出血显著高于登革热患者(p均小于0.05)。血液学参数结果提示重症登革热患者的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、草氨酸氨基转移酶(AST)、白细胞计数(WBC)、活化部分凝血酶原时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)显著性高于登革热患者(p均小于0.05),而白蛋白(ALB)和PLT计数(PLT)则均显著性低于登革热患者。AST和ALB对诊断重症登革热的价值较低(ROC曲线下面积在0.5-0.7之间),ALT.WBC和APTT诊断重症登革热的价值也较低(虽然ROC曲线下面积在0.7-0.9之间,但是95%置信区间包含有0.5),PLT和PT对重症登革热的诊断,其准确性中等。结论1.对我国大陆流行的DENV-1和DENV-2,分析登革病毒在选择压力下的演化和变异,DENV-1的全长基因序列、DENV-2的全长基因和开放阅读框的基因序列是合适的目的基因,而E基因区域可能不合适。2000年以后主要为DENV-1的流行,E基因和NS1基因区域的氨基酸突变可能是原因之一；而不同区域的DENV-1和DENV-2的流行程度可能与NS3基因区域的氨基酸突变有关。2.单用NS1检测法可以用来确诊登革病毒的感染,NS1联合IgM检测法可以用来监测登革热。NS1检测法可以鉴别出DENV-1和DENV-3。此外,商用Dengue NS1 Ag STRIP试剂是诊断和病毒血清分型的最佳试剂。3.登革热患者存在恶心/呕吐、持续腹痛、皮疹、明显出血倾向和肝肿大的登革热患者更易进展为重症登革热,而头痛的患者进展为重症登革热的概率较低。其他因素,如疲乏、眶后痛、腹泻和束臂试验不能预测重症登革热。4.我国大陆登革热患者中,女性更易进展为重症登革热。与重症登革热相关的临床特点和血液学参数为：意识障碍、嗜睡、黄疸、胸腔积液、腹水、阴道出血、ALT、AST、ALB、WBC、PLT、APTT和PT。二分类的Logictic回归分析结果显示,性别和血液学参数(WBC、PLT和PT)是可以用来预测重症登革热。
【关键词】：登革病毒 登革热 基因 时空特点 预测 临床特点
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.8
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-24
• 前言24-31
• 第一章 我国大陆登革病毒全基因的时空分析31-51
• 1 材料31-32
• 2 方法32-34
• 3 结果34-48
• 4 讨论48-51
• 第二章 NS1蛋白捕获法诊断登革热的系统评价51-72
• 1 资料与方法51-53
• 2 结果53-69
• 3 讨论69-72
• 第三章 临床症状和体征预测重症登革热的系统评价72-85
• 1 材料与方法72-74
• 2 结果74-82
• 3 讨论82-85
• 第四章 2014年广东省212例登革热的临床特征分析85-95
• 1 研究对象与方法85-86
• 2 结果86-92
• 3 讨论92-95
• 全文总结95-96
• 参考文献96-110
• 缩略语词汇表110-112
• 博士期间论文发表情况112-114
• 致谢114-116

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本文编号：937373