ClC-2氯通道在糖尿病难愈性创面表皮干细胞迁移运动中的作用和机制

发布时间：2017-10-04 06:24

  本文关键词：ClC-2氯通道在糖尿病难愈性创面表皮干细胞迁移运动中的作用和机制

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【摘要】：糖尿病难愈性创面是糖尿病患者除全身系统性疾病外发生的一种常见的、严重的局部并发症。引起糖尿病创面延迟愈合的原因也是多方面的,局部创面再上皮化进程的破坏可导致创面的延迟愈合。很多糖尿病创面经传统的标准处理后并没有取得良好的疗效。细胞疗法是治疗糖尿病难愈性创面的一种很有发展远景的治疗手段。无论是急性还是慢性创面,实现再上皮化对创面的封闭和愈合至关重要。而在急性创面的再上皮化进程中扮演着关键角色的表皮干细胞在慢性创面包括糖尿病创面的愈合方面却没有发挥相似的作用。皮肤的自我更新及自稳态调节有赖于功能正常的表皮干细胞的存在。当皮肤受到损伤后,干细胞开始分裂成姐妹细胞并迁移到创面参与皮肤的再上皮化过程。表皮干细胞(ESCs)在皮肤发生急性创伤后在多种因素的作用下向创缘聚集并参与创面的再上皮化修复。但在糖尿病足创面,上述修复机制却没有发挥作用,我们推测可能是糖尿病内环境下,表皮干细胞向创面迁移的能力被抑制,从而延迟了创面的愈合。容积激活型(或敏感型)氯通道(VACC)是细胞在渗透性刺激的情况下能激活出容积激活型氯电流((ICl,vol)的一类阴离子通道。在低渗性刺激、细胞发生肿胀后,Cl-和K+分别通过VACC和K+离子通道(如BK通道)外流,伴随着渗透性水分子外流,导致细胞的容积减小。上述过程称之为调节性容积减少(RVD)。VACC及RVD被证实参与了细胞的增殖及迁移功能,而后两者对于创面的再上皮化进程是非常重要的。研究证实Cl C-2氯通道参与了细胞内Cl-离子浓度的调节进而调控细胞容积改变及细胞的迁移。然而,Cl C-2氯通道是否参与了表皮干细胞迁移运动并在糖尿病难愈性创面的形成过程中发挥作用尚不清楚。目的:分析糖尿病高糖状态、Cl C-2通道及细胞迁移之间的相关性,探讨Cl C-2通道在糖尿病表皮干细胞迁移运动中的作用及相关的调控机制,充实糖尿病创面延迟愈合的基础理论,为指导临床实践打下基础。方法:糖尿病的高糖状态是引起ESCs细胞功能改变的细胞内环境,本研究用高糖培养的方法培养用Ⅳ型胶原分离的大鼠表皮干细胞,检测并观察糖尿病状态下Cl C-2通道的表达、容积敏感型氯电流及细胞迁移能力的改变情况;用慢病毒载体将Cl C-2 m RNA对应的sh RNA导入正常表皮干细胞以模拟糖尿病状态下Cl C-2通道表达受抑制的情况,观察相应的细胞功能如迁移能力和ICl,vol改变的情况;最后从PI3K信号入手,探讨糖尿病影响Cl C-2表达和相关功能改变的机制。结果:1.细胞免疫荧光法检测Ⅳ型胶原快速黏附法分离培养得到的细胞。细胞上β1-整合素及K19蛋白表达均为阳性,说明该法培养所得细胞为表皮干细胞;2.免疫细胞荧光、Real time-PCR和免疫蛋白印迹检测的ESCs的细胞Cl C-2通道表达情况,发现Cl C-2在细胞膜上表达,糖尿病状态下Cl C-2通道的表达下降;全细胞膜片钳技术检测ESCs的容积敏感型氯电流,高糖培养的ESCs容积敏感型氯电流受到抑制;此外,细胞划痕实验及Transwell小室实验结果显示高糖培养的ESCs的体外迁移能力下降;3.酶切证实携带sh RNA的慢病毒载体构建成功,可有效感染ESCs,估计感染效率达到90%以上,镜下观察细胞形态无明显变化;Real time-PCR和免疫蛋白印迹检测各组Cl C-2通道表达抑制效率后以抑制效率最高的进行进一步实验;4.慢病毒转染的ESCs的容积敏感型氯电流及细胞体外迁移能力受到抑制;5.Western blotting检测发现高糖培养的ESCs中PI3K的磷酸化水平下降;6.PI3K抑制剂渥曼青霉素可以抑制Cl C-2通道的表达、细胞的ICl,vol及迁移运动。结论:1.糖尿病大鼠表皮干细胞Cl C-2通道的表达下降,同时细胞的容积敏感型氯电流及迁移能力受到抑制,这三者之间可能存在相关性;2.慢病毒介导的Cl C-2 m RNA对应的sh RNA可以有效抑制Cl C-2通道的表达,成功模拟了糖尿病状态下Cl C-2表达下降、容积敏感型氯电流及细胞体外迁移能力受抑制的情况,说明ESCs的Cl C-2通道与细胞ICl,vol及迁移能力有关;3.糖尿病状态通过抑制PI3K的磷酸化而抑制Cl C-2的表达,进而抑制了ESC的容积敏感型氯电流及体外迁移能力。
【关键词】：糖尿病难愈性创面 高糖培养 表皮干细胞 Cl C-2 容积敏感型氯电流 细胞迁移
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 英文摘要7-10
• 中文摘要10-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 糖尿病大鼠表皮干细胞Cl C-2 通道表达及功能受抑制14-43
• 2.1 大鼠表皮干细胞的分离、培养及鉴定14-19
• 2.2 糖尿病大鼠表皮干细胞Cl C-2 通道的表达改变19-30
• 2.3 糖尿病大鼠表皮干细胞迁移能力的改变30-35
• 2.4 糖尿病大鼠表皮干细胞的容积敏感型氯电流的改变35-41
• 2.5 讨论41-43
• 第三章 Cl C-2 shRNA慢病毒的构建、鉴定以及转染后对ESC功能的影响43-59
• 3.1 ClC-2 shRNA慢病毒的构建、鉴定及对表皮干细胞的转染43-53
• 3.2 pGreenPuro-CLCN2 RNAi慢病毒对表皮干细胞迁移功能的影响53-55
• 3.3 p Green Puro-CLCN2 RNAi慢病毒对表皮干细胞容积敏感型氯电流的影响55-57
• 3.4 讨论57-59
• 第四章 糖尿病状态通过抑制PI3K通路抑制ClC-2 的表达及功能59-69
• 4.1 糖尿病状态抑制表皮干细胞PI3K的磷酸化作用59-61
• 4.2 渥曼青霉素对表皮干细胞Cl C-2 表达的影响61-63
• 4.3 渥曼青霉素对表皮干细胞迁移能力的影响63-65
• 4.4 渥曼青霉素对表皮干细胞容积敏感型氯电流的影响65-66
• 4.5 讨论66-69
• 全文总结69-70
• 参考文献70-79
• 文献综述一 糖尿病创面研究进展79-92
• 参考文献84-92
• 文献综述二 干细胞与皮肤创面修复92-105
• 参考文献98-105
• 文献综述三 离子通道与细胞迁移105-118
• 参考文献112-118
• 攻读博士学位期间的研究成果118-119
• 致谢119

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 苏静;周磊;张宏宇;孙连坤;康劲松;;氯通道ClC-2反义寡核苷酸对顺铂作用下神经胶质瘤U251细胞侵袭力的影响[J];吉林大学学报(医学版);2009年01期

2 郭锐;曹川;王珍祥;李U，

本文编号：969128