胃癌中HMGA2通过SOX7调控上皮间质转化和肿瘤细胞干性获取的机制研究

发布时间：2017-10-03 17:33

  本文关键词：胃癌中HMGA2通过SOX7调控上皮间质转化和肿瘤细胞干性获取的机制研究

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【摘要】：背景和目的：胃癌是消化道肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一。近年来,随着肿瘤综合治疗的开展,胃癌死亡率虽有所下降,但治疗效果并无突破性进展,在国内其发病率和死亡率仍然位于各种恶性肿瘤的前列。目前认为,导致胃癌治疗失败、预后不佳乃至患者死亡的主要原因是肿瘤的浸润和转移,而癌细胞的侵袭和迁移是肿瘤转移的关键环节。大量研究表明,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)与恶性肿瘤的浸润转移密切相关,也是近年来探讨肿瘤转移的研究热点。EMT是多细胞生物胚胎发生发育过程中的一种常见现象。在EMT过程中,上皮细胞发生表型转化,演变为类似成纤维细胞的间质细胞表型,主要表现为上皮细胞极性消失,连接上皮细胞间紧密连接相关蛋白表达降低,细胞外基质(extracellular matrix, ECM)增多,细胞侵袭和抗凋亡能力增强；同时还可使肿瘤细胞获得干细胞的特性,诱导肿瘤干细胞(tumor stem cells, TSCs)的发生,进一步促进肿瘤的侵袭转移。高迁移率族蛋白A2 (High mobility group protein A2, HMGA2)是一种非组蛋白染色体蛋白,作为一种结构转录因子,其本身缺乏转录活性,但是可以通过改变染色质结构来调节其他基因的转录,进而影响胚胎形成、组织发育和肿瘤发生。HMGA2在分化成熟组织中低表达或不表达,而在胚胎发育和恶性肿瘤组织中表达明显上调。此外,HMGA2能通过干扰细胞周期而促使上皮细胞间质转化及肿瘤细胞获得干细胞特性,进而维持肿瘤细胞的分化和自我更新能力。SOX7是含HMG domain的SOX转录因子家族SOX F亚族的一个成员。研究发现,SOX7基因的C端存在转录激活结构域,作用机制主要由于该基因是Wnt/β-catenin信号通路的负性调节因子,通过抑制Wnt/p-catenin信号通路,使细胞的异常增生活动终止,从而发挥其肿瘤抑制的功能。本课题前期研究使用染色质共沉淀加启动子芯片方法(ChβP-on-chip),并通过KEGG-PATHWAY分析芯片结果,预测SOX7可能是HMGA2通过Wnt/p-catenin信号通路影响胃癌细胞发生EMT的下游靶基因。本研究旨在从胃癌组织水平、体外细胞学检测及裸鼠移植瘤体内验证等方面,探讨转录因子HMGA2通过SOX7调控胃癌细胞发生EMT和肿瘤细胞干性获取的机制。方法：(1)采用免疫组化SP法检测158例胃癌组织中HMGA2与Oct4的表达,分析两者在胃癌组织中表达水平的相关性、两者表达与临床病理参数之间的关系,以及对预后的影响；(2)挑选合适的胃癌细胞株(MKN-28,SGC-7901和MKN-45),构建过表达HMGA2的慢病毒载体,转染胃癌细胞MKN-28和SGC-7901细胞,建立稳定过表达]HVIGA2的胃癌细胞株,并通过western-blot验证干预效果；(3)用免疫荧光和western-blot检测过表达HMGA2前后胃癌细胞中干细胞标志物CD44和Oct4的表达,并通过Trans well、BrdU和Wound Healing等方法进行过表达HMGA2前后胃癌细胞侵袭、增殖、迁移等功能学的检测；(4)通过免疫组化及western-blot分别检测胃癌组织中HMGA2和SOX7的表达,并分析二者表达的相关性；再从细胞水平检测过表达]HMGA2前后胃癌细胞中HMGA2和SOX7的表达情况；(5)用生物信息学方法(UCSC软件)分析并预测SOX7基因的启动子区,然后构建SOX7启动子与HMGA2作用的荧光素酶(Luciferase)报告基因,进一步验证二者是否存在作用关系；(6)针对SOX7基因启动子序列,设计合成SOX7-siRNA,用后者瞬时转染内源性高表达SOX7的MKN28细胞株,并采用qPCR和western-blot验证转染效果；(7)通过western-blot检测干扰SOX7前后EMT标志物E-cadherin, N-cadherin和Vimentin以及干细胞标志物CD44和Oct4的表达情况,并进行相应的细胞功能学检测；(8)通过裸鼠移植瘤模型观察胃癌细胞在干预SOX7前后的成瘤能力、生长情况和裸鼠生存时间,并通过免疫组化判断胃癌细胞在干扰SOX7后是否在体内也能促进EMT和肿瘤细胞干性获取,从而进一步说明SOX7是否是EMT和肿瘤细胞干性获取的调控基因。结果：(1)胃癌组织中HMGA2与Oct4的表达成正相关,且二者表达与胃癌患者淋巴结转移、血管入侵、肝转移及临床TNM分期有关。(2)过表达HMGA2的慢病毒载体转染内源性低表达]HMGA2的胃癌细胞株MKN28和SGC-7901后可使其迁移、侵袭能力明显增强,但增殖能力降低；干细胞标志物CD44和Oct4表达明显升高。(3)胃癌组织中HMGA2与SOX7的表达呈负相关；SOX7启动子荧光素酶(Luciferase)报告基因发现HMGA2与其下游的SOX7存在作用关系,HMGA2过表达后可以明显降低SOX7启动子活性。(4) SOX7-siRNA干扰内源性高表达SOX7的MKN28细胞后,E-cadherin表达降低,N-cadherin、Vimentin、CD44及Oct4表达升高；同时细胞侵袭迁移能力增强,增值能力抑制；裸鼠移植瘤实验发现,使用SOX7-SiRNA干扰的MKN28细胞成瘤能力更强,但是移植瘤的生长速度减慢。结论：HMGA2和Oct4在胃癌组织中高表达,且与肿瘤的浸润转移及患者的预后有关；稳定过表达HMGA2及用SOX7-siRNA干扰胃癌细胞都可以促进胃癌细胞发生EMT和肿瘤细胞干性获取,可以增强胃癌细胞的侵袭迁移和成瘤能力；胃癌中HMGA2和SOX7表达呈负相关；HMGA2与其下游的SOX7存在结合靶点,胃癌中]HMGA2可以通过抑制SOX7基因启动子的转录活性调控EMT及肿瘤细胞干性获取。
【关键词】：HMGA2 SOX7 上皮间质转化 肿瘤细胞干性获取 胃癌
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照6-10
• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-20
• 前言20-24
• 参考文献22-24
• 第一部分 HMGA2与OCT4在胃癌组织中的表达及其临床意义24-47
• 1 材料与方法24-35
• 2 结果35-41
• 3 讨论41-44
• 参考文献44-47
• 第二部分 HMGA2对胃癌细胞生物学特性及干性获取的影响47-69
• 1 材料与方法48-54
• 2 结果54-61
• 3 讨论61-65
• 参考文献65-69
• 第三部分 SOX7启动子荧光素酶报告质粒的构建及HMGA2对其调控的验证69-93
• 1 材料与方法70-78
• 2 结果78-87
• 3 讨论87-90
• 参考文献90-93
• 第四部分 SOX7在HMGA2调控胃癌细胞上皮间质转化及干性获取中的作用93-114
• 1 材料与方法93-102
• 2 结果102-108
• 3 讨论108-111
• 参考文献111-114
• 全文总结114-116
• 文献综述116-133
• 参考文献126-133
• 致谢133-134
• 攻读学位期间的主要研究成果134

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本文编号：965805