静电纺丝纳米纤维支架诱导iPS细胞心肌分化及机制研究

发布时间：2017-10-06 05:42

  本文关键词：静电纺丝纳米纤维支架诱导iPS细胞心肌分化及机制研究

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【摘要】：【研究背景】在世界范围内,特别是在我国及主要发达国家,心血管疾病已经成为导致患者死亡的首要病因。心脏衰竭、慢性缺血性心肌病与急性心肌梗死是其中三种最常见的死亡原因。到目前为止,临床上对于因功能性心肌细胞损失过多所导致的终末期心脏衰竭,除了心脏移植之外还没有确切的治疗方法。由于供体稀缺和免疫排斥等相关问题,心血管疾病的治疗迫切需要新方法,而基于干细胞和组织工程技术的组织器官再生将是未来研究发展的重点方向。心肌再生需要有种子细胞生成大量同源心肌细胞,这一点已经逐渐成为学者及临床医生们的共识。在各种干细胞中,诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,i PSC)被认为是最理想的种子细胞来源。而作为种子细胞生长分化的载体,材料支架是另一至关重要的环节。心肌细胞(Cardiomyocyte,CM)生长在细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的环绕之中,而静电纺丝纳米纤维支架能够做到结构高度类似于天然ECM,从而能够在体外为种子细胞生长分化提供适宜的物理微环境。早期为了解决i PSC向CM分化的效率问题,大多研究集中在使用细胞因子对干细胞进行高效诱导定向分化,应用仿生支架构建人工心肌方面研究很少。在为数不多的人工心肌构建方面的当研究中,大多研究采用的是已分化完成的CMs来与支架共培养,另一些研究则考虑如何将ECM的成份制作为支架或添加到材料支架内以用于CMs的负载培养,而对于仿生纳米纤维支架的物理微环境对于i PSC向CMs分化的作用尚不清楚。支架对干细胞心肌方向分化的影响或作用,正是构建组织工程心肌亟需了解的问题。【目的】研究三维纳米纤维仿生支架的物理微环境对i PSC向CM分化的影响及其机制,为组织工程心肌支架构建提供理论依据。【方法】1)采用静电纺丝技术生产聚己内酯(Poly-(ε-caprolactone),PCL)纳米纤维,构建具备三维结构的纳米纤维仿生支架。2)评价支架的各项理化性质,并与小鼠胚胎成纤维细胞共培养以评价支架的安全性及细胞相容性。3)携带GFP转基因的Oct4-GFP+小鼠诱导多能干细胞(murine induced pluripotent stem cell,mi PSC)负载到纳米纤维仿生支架上共培养,荧光显微镜直接追踪观察mi PSCs的生长及多能性维持情况,并评估支架用于mi PSC培养的可行性。4)采用单层法(monolayer method)将Oct4-GFP+mi PSCs直接粘附培养在PCL三维纳米纤维支架上,不添加分化诱导剂自发分化,探讨PCL纳米纤维支架对mi PSC向CM分化可能的影响。5)提取总蛋白与不同时间点总m RNA,比较PCL纳米纤维支架与无支架培养对mi PSCs向CM分化的影响,探讨其影响因素。6)特异性调节细胞分化不同阶段的Wnt/β-catenin信号活性,探讨三维PCL纳米纤维支架影响分化可能的分子机制。【结果】1)静电纺丝技术成功制得光滑连续,直径为纳米级别的PCL纤维和PCL/gelatin复合型纤维,并成功构建出孔隙结构丰富的三维立体纳米纤维仿生支架。2)PCL与明胶成份混纺或直接在纤维表面包被明胶,均可以克服材料原有的不利属性,提高细胞亲和粘附能力,证实这种处理后的PCL纳米纤维支架具备良好的细胞相容性,适合生物组织工程应用。3)带有绿色荧光蛋白标记物的Oct4-GFP+mi PSCs在PCL纳米纤维支架上单独培养,一定时间内能够保持细胞干性标志物表达,表明PCL纳米纤维支架可用作基底用于mi PSC的自我更新扩增培养。4)单层法培养mi PSC于PCL纳米纤维支架上,发现mi PSC直接粘附PCL纳米纤维后,不添加外源性诱导因子情况下也能够自发性分化出CM。5)三维PCL纳米纤维的这种促心肌细胞分化的作用明显强于2D培养皿,这种作用与其表面独特物理结构的微观形貌具有密切关系。6)选择性激动剂和抑制剂调节细胞内Wnt/β-catenin信号通路,证实这种纳米纤维支架通过调节mi PSCs内的Wnt/β-catenin信号从而促进CM的分化。综上所述,可以得出结论,三维PCL纳米纤维仿生支架不仅可用于mi PSC扩增培养,而且可通过其提供的物理生物信号调节细胞内Wnt/β-catenin信号活性从而促进mi PSC向心肌细胞的分化。
【关键词】：诱导多能干细胞 细胞分化 心肌细胞 聚己内酯 静电纺丝 纳米纤维支架 Wnt/β-catenin信号 机制
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-30
• 实验一 纳米纤维支架的构建及其性质研究30-50
• 1 材料31-32
• 2 方法32-35
• 3 结果35-45
• 4 讨论45-50
• 实验二 纳米纤维支架诱导MIPSC向心肌细胞分化50-72
• 1 材料50-52
• 2 方法52-61
• 3 结果61-69
• 4 讨论69-72
• 实验三 纳米纤维支架促进MIPSC向心肌细胞分化的机制探讨72-92
• 1 材料72-75
• 2 方法75-80
• 3 结果80-88
• 4 讨论88-92
• 小结92-94
• 参考文献94-105
• 个人简历和研究成果105-106
• 致谢106-107

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