缺血缺氧性视神经视网膜损伤的分子机制研究

发布时间：2017-10-07 17:43

  本文关键词：缺血缺氧性视神经视网膜损伤的分子机制研究

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【摘要】：第一部分Homer1a在眼部缺血缺氧损伤中的作用1研究背景眼部缺血缺氧后视网膜神经节细胞发生病理改变,可引起视神经不可逆的损伤,导致视力损失甚至失明。目前研究发现,眼部缺血缺氧损伤主要发生在视网膜动静脉阻塞、未成熟的视网膜病变、糖尿病性的视网膜病变、青光眼等视网膜血管阻塞所致的缺血性疾病中,表现为组织细胞缺血及缺氧损伤后,细胞正常结构消失、功能破坏等。因此,保护视神经、减少视网膜神经节细胞缺血缺氧后损伤等研究具有重要的意义和作用。前期文献报道提示,Homer1a作为一种重要的突触后致密物质,在创伤性脑损伤中具有重要作用,可通过调节Erk信号通路发挥神经保护作用。也有研究发现Homer1和眼部疾病密切相关,但在眼部缺血缺氧损伤后Homer1a的改变与作用尚不明确,仍需进一步研究。本研究的目的是:(1)明确眼部缺血缺氧后Homer1a的表达变化;(2)探讨在眼部缺血缺氧后Homer1a对视网膜神经节细胞的作用及其机制。2方法(1)细胞模型:原代培养小鼠视网膜神经节细胞,采用氧糖剥夺模型;(2)动物模型:生理盐水诱导小鼠眼部缺血缺氧模型;(3)蛋白表达:采用Western blot检测视网膜神经节细胞或视网膜中Homer1a、Erk、磷酸化Erk(p-Erk)、剪切的Caspase3(cleaved-Caspase3)、Caspase3等蛋白在缺血缺氧后的表达变化;(4)细胞损伤:TUNEL染色及Caspase3剪切水平检测视网膜神经节细胞凋亡情况,β-III-微管蛋白染色检测视网膜缺血缺氧后的视网膜神经节细胞存活情况;(5)药物干预:应用Erk抑制剂(PD98059)抑制Erk激活;(6)基因干涉/过表达:采用慢病毒介导的基因干涉/过表达手段调节Homer1a表达;(7)基因敲除动物:采用Homer1a基因敲除动物验证Homer1a神经保护作用。3结果和结论本实验分别使用细胞及动物缺血缺氧模型,通过Western blot、基因干涉/过表达、TUNEL染色、基因敲除等方法,研究Homer1a在眼部缺血缺氧损伤中的表达改变、作用及其机制。我们的研究发现,体外视网膜神经节细胞氧糖剥夺或体内眼部缺血缺氧损伤后,Homer1a及p-Erk表达水平均显著升高。在体外实验中,上调Homer1a后,p-Erk表达水平显著下降,视网膜神经节细胞的凋亡率明显降低;而下调Homer1a蛋白,p-Erk表达水平升高,视网膜神经节细胞凋亡率也增高。此外,抑制Erk活性,Home1a表达明显增加,视网膜神经节细胞凋亡率明显下降。以上实验表明,氧糖剥夺损伤后,Homer1a可保护视网膜神经节细胞;在相同损伤条件下,p-Erk表达水平和细胞凋亡率有相关关系,高表达p-Erk视网膜神经节细胞凋亡率升高,而低表达p-Erk视网膜神经节细胞凋亡率降低;Homer1a与Erk信号通路相互作用,发挥神经保护作用。进一步的体内实验表明:小鼠眼部缺血缺氧造模后,Homer1a基因敲除小鼠(KO,Homer1a-/-)视网膜神经节细胞存活率及突起连接较野生型小鼠(WT,Homer1a+/+)显著降低,进一步证实视网膜缺血缺氧损伤后Homer1a可能有神经保护作用。综上,在眼部缺血缺氧损伤中Homer1a可能通过调节Erk信号通路发挥神经保护作用。第二部分NLRP3炎性体在眼部缺血缺氧损伤中的作用1研究背景眼部缺血缺氧可导致眼底部神经组织不可逆损伤,该种损伤存在于多种眼部疾病的发生与发展过程中。近期研究表明,眼部的缺血缺氧损伤最早发生在视乳头区,众所周知,视乳头区是视神经出眼入颅的部位,该部位视神经可直接和小胶质细胞接触,当小胶质细胞受刺激被激活后,可迅速释放炎性因子等,引发炎症级联反应,最终引起细胞组织损伤。我们的前期实验发现,在小鼠和人的视网膜乳头区NLRP3炎性体高表达。NLRP3炎性体作为Caspase1激活的平台,在炎症级联反应中具有重要作用。但NLRP3炎性体激活并导致神经节细胞损伤的具体机制尚不明确,仍需进一步研究。本研究的目的是:(1)明确NLRP3炎性体在眼部缺血缺氧损伤中的改变与作用;(2)探讨NLRP3炎性体在眼部缺血缺氧损伤后的确切作用机制。2方法(1)动物模型:聚苯乙烯微球前房注射诱导小鼠眼部缺血缺氧模型;(2)免疫荧光染色:β-Ⅲ-微管蛋白标记视网膜神经节细胞及Iba1染色标记小胶质细胞;(3)分子表达:采用荧光实时定量的方法检测动物视网膜乳头区组织中炎性体相关蛋白在缺血缺氧后的表达变化。3结果和结论本实验使用聚苯乙烯微球前房注射诱导小鼠眼部缺血缺氧模型,通过免疫荧光染色、荧光实时定量等方法,研究NLRP3炎性体在眼部缺血缺氧损伤中的作用及机制。本研究发现,NLRP3炎性体在正常人及小鼠视网膜乳头区均高表达。小鼠眼部缺血缺氧损伤后,NLRP3敲除小鼠(KO,NLRP3-/-)及ASC敲除小鼠(KO,ASC-/-)视网膜神经节细胞存活率及突起连接较野生型小鼠(C57/BL6J)显著增加,证实视网膜缺血缺氧损伤后NLRP3炎性体可能在视网膜神经节细胞损伤中起重要作用。进一步荧光实时定量方法发现,眼部缺血缺氧损伤后,野生型小鼠(C57/BL6J)视网膜乳头区NLRP3炎性体相关分子Caspase1、IL-1β和IL-18表达显著升高。以上结果证明,NLRP3炎性体在小鼠眼部缺血缺氧损伤中,活化小鼠视乳头区Caspase1、IL-1β和IL-18等炎性因子。此外,IL-1R敲除小鼠(KO,IL-1R-/-)及IL-18敲除小鼠(IL-18-/-)眼部缺血缺氧损伤后,较野生型小鼠(C57/BL6J),其视网膜神经节细胞存活率及突起连接明显增加,提示IL-1β和IL-18等炎性因子可招募下游分子,引发炎症级联反应,导致视网膜神经节细胞损伤。以上结果证明,NLRP3炎性体在眼部缺血缺氧损伤中可通过激活Caspase1活化并释放IL-1β和IL-18,引发视网膜神经节细胞损伤,破坏其突起连接,发挥神经损伤作用。
【关键词】：眼部缺血缺氧 视乳头 Homer蛋白 Erk信号通路 NLRP3炎性体
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.1
【目录】：

• 缩略语表6-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 前言15-17
• 文献回顾17-34
• 第一部分 Homer1a在眼部缺血缺氧损伤中的作用34-55
• 1 材料34-39
• 1.1 实验动物34-35
• 1.2 慢病毒载体构建及包装35
• 1.3 实验试剂35-37
• 1.4 实验仪器37-38
• 1.5 试剂38-39
• 2 方法39-43
• 2.1 小鼠视网膜神经节细胞原代培养及氧糖剥夺模型39-40
• 2.2 慢病毒视网膜神经节细胞转染40
• 2.3 蛋白质提取及定量40-41
• 2.4 Western blot检测41
• 2.5 TUNEL染色41-42
• 2.6 前房注射诱导小鼠眼部缺血模型42
• 2.7 β-Ⅲ-微管蛋白染色标记视网膜神经节细胞42-43
• 2.8 视网膜神经节细胞的量化观察43
• 2.9 数据处理与分析43
• 3 结果43-52
• 3.1 视网膜神经节细胞氧糖剥夺缺氧损伤后Homer1a、p-Erk和cleaved-casapase3 改变43-47
• 3.2 小鼠眼部缺血缺氧损伤后视网膜Homer1a及p-Erk的变化47-48
• 3.3 视网膜神经节细胞氧糖剥夺缺氧损伤后抑制Erk激活对凋亡的影响48-49
• 3.4 Homer1a表达改变对视网膜神经节细胞的影响49-51
• 3.5 Homer1a基因敲除小鼠眼部缺血缺氧损伤后视网膜神经节细胞改变51-52
• 4 讨论52-55
• 第二部分 NLRP3炎性体在眼部缺血缺氧损伤中的作用55-83
• 1 材料55-57
• 1.1 实验动物55
• 1.2 实验试剂55-56
• 1.3 实验仪器56-57
• 2 方法57-66
• 2.1 聚苯乙烯微球前房注射诱导小鼠眼部缺血缺氧模型57
• 2.2 小鼠眼压测量57-58
• 2.3 β-Ⅲ-微管蛋白标记视网膜神经节细胞58-59
• 2.4 视网膜神经节细胞的量化观察59
• 2.5 视网膜神经节细胞轴突的量化观察59
• 2.6 总RNA提取59-61
• 2.7 RNA质量、浓度测定61-63
• 2.8 c DNA的合成63-64
• 2.9 荧光实时定量检测表达64-66
• 2.10 视乳头免疫组织荧光66
• 3 结果66-79
• 3.1 聚苯乙烯微球前房注射诱导小鼠眼部缺血缺氧模型66-69
• 3.2 NLRP3炎性体在C57/BL6J小鼠视乳头中的表达69-70
• 3.3 小鼠高眼压缺血缺氧损伤后NLRP3、ASC分子对视网膜神经节细胞的作用70-74
• 3.4 小鼠高眼压缺血缺氧损伤后IL-1β 和IL-18分子对视网膜神经节细胞的作用74-77
• 3.5 高眼压缺血缺氧损伤后小胶质细胞在视乳头区的迁徙作用77-79
• 4 讨论79-83
• 小结83-85
• 参考文献85-110
• 个人简历和研究成果110-112
• 致谢112

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本文编号：989215