基于DNA甲基化途径叶酸对阿尔茨海默病模型作用机制的研究

发布时间：2017-10-08 00:33

  本文关键词：基于DNA甲基化途径叶酸对阿尔茨海默病模型作用机制的研究

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【摘要】：目的阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的病理特征是细胞外淀粉样蛋白(amyloid-βpeptide,Aβ)沉积,以及神经细胞内高磷酸化tau蛋白形成神经纤维节缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。AD的发生与多种营养素缺乏有关,叶酸作为一碳单位供体参与一碳单位代谢,进而参与体内多种甲基化过程,包括DNA甲基化和蛋白质甲基化等。而一碳单位代谢异常可增加哺乳动物脑海马区Aβ沉积,改变tau蛋白磷酸化水平。异常的DNA和蛋白质甲基化可能是与AD病理机制相关的表观遗传学机制。该研究将探讨叶酸通过DNA甲基化途径对AD模型的作用机制,为叶酸防治AD提供科学依据和新的思路。方法采用三种AD细胞模型和APP/PS1双转基因小鼠AD模型研究叶酸对AD模型的作用机制。三种细胞模型分别为稳定转染APP695的小鼠N2a细胞,Aβ低聚物诱导的神经元细胞损伤模型和磷酸酯酶抑制剂诱导损伤的人神经母细胞(SH-SY5Y)瘤模型。分别模拟基因异常以及AD细胞内和细胞外病理机制。体内实验采用APP/PS1双转基因小鼠,对体外实验结果加以验证。体外实验采用不同浓度叶酸(2.8-40μmol/L)孵育N2a-APP细胞96 h,并于细胞中添加甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)阻断剂,检测各组细胞甲基化潜能,DNMT活性,APP,PS1和Aβ的表达。不同浓度叶酸干预由Aβ低聚物造成细胞AD样损伤的原代培养大鼠海马神经元细胞和小鼠神经元HT-22细胞96 h,检测各组细胞DNMT活性,APP和PS1的表达,以及细胞活力。不同浓度叶酸(0-40μmol/L)作用于由磷酸酶抑制剂(okadaic acid,OA)(10 nmol/L)孵育的人神经母细胞瘤(human neuroblastoma cells,SH-SY5Y)96 h。检测叶酸对tau蛋白磷酸化的影响。体内实验采用七月龄APP/PS1双转基因AD小鼠模型检测叶酸干预后动物脑内Aβ的表达状况。APP/PS1双转基因小鼠饲喂叶酸缺乏饲料或普通饲料,并灌胃叶酸和/或S-腺苷蛋氨酸(s-adenosylmethionine,SAM),采用免疫组化、western blot和RT-pcr法检测APP,PS1和Aβ的表达;采用高效液相色谱法检测肝脏组着和脑组织中SAM和SAH的表达;采用焦磷酸测序法检测APP、PS1基因的甲基化水平。结果叶酸干预N2a-APP细胞实验结果显示,叶酸提高APP转基因细胞甲基化潜能,DNMTs基因和蛋白表达水平及其活性,提高APP和PS1甲基化水平。进而,叶酸降低APP基因表达,PS1基因和蛋白表达,降低Aβ蛋白表达,同时抑制DNMT活性后Aβ蛋白表达增加。叶酸干预神经元细胞的实验结果显示,Aβ低聚物降低神经元细胞DNMT活性,增加PS1和APP表达,并降低细胞活力。补充叶酸后神经元细胞甲基化潜能和DNMT活性提高,PS1和APP基因启动子区甲基化水平增高,降低PS1和APP表达,并提高细胞活力。而OA孵育的SH-SY5Y细胞tau蛋白Ser396位点高磷酸化,叶酸添加可抑制tau蛋白磷酸化,最大抑制剂量为40μmol/L。叶酸通过抑制去甲基化PP2A降低tau蛋白磷酸化。高叶酸(20和40μmol/L)可增加细胞活力和细胞甲基化潜能。体内实验结果表明,转基因小鼠灌胃叶酸60天后,血清叶酸水平明显升高,但是灌胃SAM不能明显提高血清叶酸水平。叶酸缺乏可降低动物肝脏中SAM浓度,但对SAH的影响不明显。灌胃叶酸可提高小鼠脑内DNMT活性,改变APP,PS1基因启动子区甲基化水平。叶酸缺乏可增加转基因小鼠脑内海马区APP,PS1和Aβ表达水平,灌胃叶酸可降低上述蛋白表达水平。结论体内、体外研究结果显示,叶酸对AD的作用机制,一方面可通过提高细胞甲基化潜能和调节DNMT酶活性,使APP和PS1基因甲基化并静默,进而减少Aβ蛋白蓄积,抑制Aβ低聚物对神经元细胞的毒性;另一方面叶酸可改变PP2A甲基化,进而影响tau蛋白磷酸化,从而抑制tau蛋白的异常磷酸化。
【关键词】：叶酸 阿尔茨海默病 甲基化 β-淀粉样蛋白 磷酸化tau蛋白
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16;R-332
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-13
• 前言13-20
• 研究现状、成果13-16
• 研究目的、方法16-20
• 一、叶酸对APP转基因细胞模型Aβ形成的影响及机制研究20-54
• 1.1 对象和方法20-40
• 1.1.1 实验材料20-24
• 1.1.2 方法24-40
• 1.1.3 统计分析40
• 1.2 结果40-49
• 1.2.1 叶酸对转基因细胞Aβ 淀粉样蛋白产生的影响40-42
• 1.2.2 叶酸对转基因细胞APP，PS1基因甲基化的影响42-45
• 1.2.3 叶酸对转基因细胞APP，PS1基因表达的影响45-46
• 1.2.4 叶酸对转基因细胞DNMTs基因表达及其活性的影响46-49
• 1.2.5 叶酸对转基因细胞DNA甲基化潜能的影响49
• 1.3 讨论49-53
• 1.3.1 叶酸剂量设定的依据49-50
• 1.3.2 叶酸调节细胞甲基化潜能和改变细胞DNMT酶活性50-52
• 1.3.3 含有叶酸的复合营养制剂在AD病理过程中的作用52-53
• 1.4 小结53-54
• 二、叶酸对外源性Aβ诱导体外培养神经元细胞损伤的保护作用及机制研究54-74
• 2.1 对象和方法54-59
• 2.1.1 实验材料54-55
• 2.1.2 方法55-59
• 2.1.3 统计分析59
• 2.2 结果59-70
• 2.2.1 原代细胞鉴定，细胞活力和DNMTs活力59-62
• 2.2.2 叶酸提高外源性Aβ低聚物诱导AD样损伤神经元细胞APP，PS1基因甲基化水平62-65
• 2.2.3 叶酸降低外源性Aβ低聚物诱导AD样损伤神经元细胞APP，PS1基因表达65-67
• 2.2.4 叶酸提高外源性 Aβ低聚物诱导 AD 样损伤神经元细胞 DNMTs 基因表达67-70
• 2.2.5 叶酸提高外源性Aβ低聚物诱导AD样损伤神经元细胞甲基化潜能70
• 2.3 讨论70-73
• 2.3.1 外源性Aβ低聚物可诱发神经元细胞发生类AD样损伤70-73
• 2.3.2 叶酸通过改变基因甲基化水平改善Aβ低聚物引起的神经细胞毒性73
• 2.4 小结73-74
• 三、叶酸对SH-SY5Y细胞高磷酸化tau蛋白形成的影响及机制研究74-87
• 3.1 对象和方法74-76
• 3.1.1 实验材料74
• 3.1.2 方法74-76
• 3.1.3 统计分析76
• 3.2 结果76-83
• 3.2.1 叶酸对高磷酸化tau蛋白的作用76-77
• 3.2.2 叶酸对PP2Ac蛋白表达及其甲基化的作用77-79
• 3.2.3 叶酸对SH-SY5Y细胞甲基化潜能的作用79-80
• 3.2.4 叶酸对SH-SY5Y细胞活力的作用80
• 3.2.5 tau蛋白磷酸化，PP2a蛋白去甲基化，一碳单位代谢，SH-SY5Y细胞活力和叶酸的关系80-83
• 3.3 讨论83-86
• 3.3.1 叶酸调节PP2A甲基化进而改善tau蛋白高磷酸化83-84
• 3.3.2 PP2Ac启动子区的甲基化水平调节tau蛋白磷酸化84-85
• 3.3.3 叶酸调节PP2Ac启动子区甲基化85-86
• 3.4 小结86-87
• 四、叶酸对双转基因小鼠脑内Aβ形成的影响及机制研究87-105
• 4.1 对象和方法87-91
• 4.1.1 实验材料87-88
• 4.1.2 方法88-91
• 4.1.3 统计分析91
• 4.2 结果91-103
• 4.2.1 动物体重和血清叶酸水平91-92
• 4.2.2 脑组织中APP，PS1基因及蛋白表达水平92-97
• 4.2.3 脑组织中Aβ表达水平97-99
• 4.2.4 脑内APP，PS1基因启动子区甲基化水平99-100
• 4.2.5 脑内甲基转移酶活性100-101
• 4.2.6 肝脏和脑组织中SAM，，SAH表达水平101-103
• 4.3 讨论103-104
• 4.3.1 叶酸通过调节APP，PS1基因甲基化降低转基因动物脑内Aβ水平103-104
• 4.3.2 叶酸降低转基因动物脑内Aβ水平的其他可能机制104
• 4.4 小结104-105
• 全文结论105-107
• 论文创新点107-108
• 参考文献108-118
• 发表论文和参加科研情况说明118-120
• 综述 阿尔茨海默病相关膳食因素研究120-141
• 综述参考文献127-141
• 致谢141

【共引文献】

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本文编号：991014