NLR家族分子和DAMP家族CRT分子在肿瘤发生发展中的作用及其分子机制

发布时间：2017-10-08 18:35

  本文关键词：NLR家族分子和DAMP家族CRT分子在肿瘤发生发展中的作用及其分子机制

  更多相关文章： NLRs 炎性小体 结直肠癌 NLRX1 肿瘤生物信息学分析 损伤相关分子模式 钙网蛋白 肺癌 免疫组化 CLEIA检测试剂盒

【摘要】：第一部分:NLR家族分子在结直肠癌发生发展中的作用及其分子机制目的和方法:NOD样受体(NOD-like receptors,NLRs)是固有免疫和炎症的重要调节分子,一部分NLRs识别相应配体之后能够募集Caspase-1形成一种蛋白复合物:炎性小体,进一步促进促炎因子的产生,另一部分NLRs参与调节NF-κB和MAPK信号通路,从而启动固有免疫和获得性免疫。炎症和肿瘤间存在着密切的联系,溃疡性结肠炎和克罗恩等炎症性肠炎是诱发结直肠癌的主要病因之一。至今为止,已有很多关于NLRs在小鼠结直肠癌模型中的研究,如Nlrx1-/-小鼠是结肠炎以及结肠炎相关结直肠癌模型的易感小鼠;小鼠Nlrp6和Nlrp12基因的缺失都会导致结直肠癌进展加快,恶性程度增高;但是有关NLR分子在人结直肠癌中表达分析的报道却很少。鉴于此,我们1)选择与肿瘤潜在相关的NLR家族分子:NLRP1,NLRP3,NLRP6,NLRP12,NLRC3,NLRC4,NLRC5,NOD1,NOD2,NLRX1以及与NLR家族分子结构功能相似的AIM2分子分析其在10个已收录在生物信息学数据库Oncomine平台的人结直肠癌肿瘤数据库的表达水平;2)使用Taqman荧光探针实时定量PCR,分析了这些基因在40例人结直肠癌和癌旁组织中m RNA的表达水平,并分析了它们与炎性小体相关分子(ASC和Caspase 1)以及细胞因子(IL-1β和IL-18)表达的相关性;3)选择在人结直肠癌中表达水平明显下调的NLRX1分子,观测其在数据库和40例人结直肠癌和癌旁组织中的表达,并利用Nlrx1-/-基因敲除小鼠建立三种结直肠癌模型,全面观测NLRX1/Nlrx1在人和小鼠结直肠癌发生发展中的作用。结果:1)分析Oncomine上最大、病人信息最全、有237例标本的结直肠癌TCGA数据库,发现在结直肠癌中NLR家族分子和AIM2的表达趋势可以分为三类:重要的炎症相关分子NLRC3和NLRX1,以及可以形成炎性小体的NLRP1,NLRP3,NLRC4和AIM2在结直肠癌组织中的表达水平明显低于其在正常组织中的表达水平;而NOD1和NOD2在结直肠癌组织中的表达水平显著上调;但NLRC5、NLRP6以及NLRP12在结直肠癌组织和正常组织间的表达水平无显著统计学差异;2)40例病人组织分析结果表明NLRC3、NLRP3和NLRX1在结直肠癌组织中的表达水平明显低于其在正常组织中的表达水平;3)进一步分析Oncomine另外九个结直肠癌数据库,进一步证实NLRC3、NLRP3和NLRX1在结直肠癌组织中的表达水平明显低于正常组织;4)在三种结直肠癌模型中,Nlrx1-/-小鼠与正常野生小鼠相比其结肠组织有大量的炎性息肉产生,同时NF-κB、MAPK和STAT3活化水平上调,IL-6的分泌增加。提示由于Nlrx1基因的缺失,导致NF-κB的活化以及结肠炎性息肉的形成。结论:1)40例人结直肠癌标本结合人结直肠癌数据库结果分析证实NLRC3、NLRP3和NLRX1在结直肠癌组织中的表达水平明显低于正常组织;2)证实Nlrx1分子的缺失导致小鼠结直肠癌病情加剧、进展加速,在结直肠癌发生发展中可能有潜在的保护作用。第二部分:DAMP家族CRT分子在肺癌发生发展中的作用及其分子机制目的和方法:损伤相关分子模式(Damage associated molecular patterns,DAMPs)是由死亡的、应激的或是损伤的细胞释放、分泌或者暴露于细胞表面的分子,可以为免疫系统提供危险信号,进而诱发免疫原性的细胞死亡(Immunogenic tumor cell death,ICD)。钙网蛋白(calreticulin,CRT)是DAMPs家族分子的一员。研究表明,CRT在肿瘤细胞死亡早期,从内质网转位到细胞膜,是ICD的主要诱因之一。进而,转位到细胞膜上的CRT会进一步被剪切,释放入血液中,成为潜在的肿瘤标志物。已有文献报道,在肝癌患者血清和膀胱癌患者尿液中,可溶型CRT水平显著增高。肺癌是目前常见的恶性肿瘤之一,尚未见肺癌患者血清中s CRT表达水平的报道。因此,检测肺癌患者血清中s CRT表达水平并进一步研究CRT在肺癌发生发展中的作用及其分子机制是一个值得深入讨论的问题。1)我们应用此抗原免疫BALB/c小鼠,制备并鉴定小鼠抗人CRT单克隆抗体;2)在此基础上建立可溶型CRT夹心ELISA检测试剂盒。应用此夹心ELISA试剂盒,检测正常人和肺癌患者血清中可溶型CRT水平;3)观测CRT分子在人肺癌组织中的表达及其与肺癌病理分型和分化程度的相关性;4)应用肺癌细胞系初步研究CRT膜转位的机制。结果:1)制备并鉴定了26株小鼠抗人CRT单克隆抗体;成功建立了可溶型CRT夹心ELISA试剂盒,其检测下限为0.09ng/ml;2)应用此ELISA试剂盒,发现58例肺癌患者血清中可溶型CRT的表达水平显著高于正常人血清中可溶型CRT水平;肺癌鳞癌患者血清中的可溶型CRT的表达水平显著高于腺癌、小细胞肺癌;3)免疫组化结果显示,CRT在肺癌组织上的表达与肺癌病理类型和分化程度有着明显的相关性;4)p38MAPK、ERK、JNK或AKT-PI3K通路抑制剂SB203580、U0126、PD98059或LY294002及其内质网应激诱导剂衣霉素(Tunicamycin)或毒胡萝卜素(Thapsigargin)等药物,可在不同程度上(12-24小时)诱导CRT在m RNA水平表达明显上调,但是流式检测发现CRT转位到细胞膜上的表达上调不明显。另外,新的药物BRAF V600e抑制剂PLX4720可在1h内使CRT在胞内表达水平显著升高,胞膜平均荧光强度显示CRT分子有潜在的膜转位趋势。结论:成功建立了可溶型CRT夹心ELISA检测试剂盒;肺癌患者血清中可溶型CRT水平显著升高;CRT在肺癌组织上的表达,随着分化程度的降低,从胞浆到胞膜的膜转位增加;在肺癌细胞系上用药物诱导,模拟CRT膜转位的过程,发现BRAF V600e抑制剂PLX4720可在1h内使CRT在胞内表达水平显著升高,胞膜平均荧光强度显示CRT分子有潜在的膜转位趋势,有待进一步研究。
【关键词】：NLRs 炎性小体 结直肠癌 NLRX1 肿瘤生物信息学分析 损伤相关分子模式 钙网蛋白 肺癌 免疫组化 CLEIA检测试剂盒
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 缩略语表7-9
• 中文摘要9-13
• ABSTRACT13-17
• 前言17-19
• 文献回顾19-38
• 1 NLR家族分子概述19-20
• 2 NLR家族分子的结构和命名20-24
• 3 NLR家族分子的分类和功能24-32
• 3.1 形成炎性小体的NLR家族分子24-28
• 3.1.1 NLRP325-26
• 3.1.2 NLRP626-28
• 3.1.3 AIM228
• 3.2 非形成炎性小体的NLR家族分子28-32
• 3.2.1 NLRP1229-30
• 3.2.2 NLRX130-31
• 3.2.3 NLRC331-32
• 4 NLR家族分子在人结直肠癌中的研究现状32-33
• 5 损伤相关分子模式家族CRT分子的研究现状33-38
• 5.1 DAMPs家族分子简介33-35
• 5.2 钙网蛋白和肿瘤免疫原性细胞死亡35-37
• 5.3 可溶型CRT分子在人肿瘤中的相关研究37-38
• 第一部分：NLR家族分子在结直肠癌发生发展中的作用和分子机制38-76
• 实验一：NLR家族分子在人结直肠癌中的表达及其与炎性因子的相关性38-55
• 1 材料方法38-40
• 1.1 基于Oncomine肿瘤数据库的生物信息学分析38-39
• 1.2 结直肠癌临床标本的收集39
• 1.3 从FFPE组织中提取RNA39
• 1.4 实时定量PCR39-40
• 1.5 热点图和层次聚类分析40
• 1.6 统计学分析40
• 2 结果40-53
• 2.1 基于Oncomine肿瘤数据库的人结直肠癌数据分析40-46
• 2.2 NLR家族分子在40例人结直肠癌组织标本中的表达46-48
• 2.3 炎性小体相关基因与NLR家族分子表达水平相关性分析48-50
• 2.4 NLR家族分子在Oncomine平台其它结直肠癌数据库中表达分析50-53
• 3.讨论53-55
• 实验二：NLRX1分子在人和小鼠结直肠癌中的作用研究55-76
• 1 材料方法55-58
• 1.1 实验动物55-56
• 1.2 流式细胞术鉴定小鼠骨髓移植效率56
• 1.3 结肠息肉计数及评估56
• 1.4 小鼠结直肠癌组织体外FRI成像56-57
• 1.5 结肠组织的HE染色57
• 1.6 小鼠结肠RNA的提取及实时定量分析57
• 1.7 Western Blots57-58
• 1.8 统计学分析58
• 2 结果58-75
• 2.1 NLRX1分子在人结直肠癌组织中的表达水平及其与结直肠癌临床分级的关系58-60
• 2.2 Nlrx1基因敲除小鼠在不同结直肠癌模型中的表型及其机制的初步分析60-75
• 3 讨论75-76
• 第二部分：DAMP家族CRT分子在肺癌发生发展中的表达和功能76-98
• 实验三：CRT分子在肺癌血清和组织标本中的表达和功能76-98
• 1 材料和方法76-79
• 1.1 CRT单克隆抗体的制备76
• 1.2 病人标本的收集76-77
• 1.3 可溶型CRT夹心ELISA试剂盒的建立77
• 1.4 可溶型CRT ELISA试剂盒优化77
• 1.5 流式细胞术77
• 1.6 Western blot77-78
• 1.7 免疫组化78
• 1.8 信号通路抑制剂相关实验的材料和方法78-79
• 1.9 统计学分析79
• 2 结果79-96
• 2.1 制备并鉴定CRT单抗79-81
• 2.2 建立高敏感性可用于检测可溶型CRT分子的化学发光检测试剂盒81-82
• 2.3 58例肺癌患者血清可溶型CRT的检测82-83
• 2.4 肺癌组织标本中CRT表达水平及其与肿瘤细胞分化程度的关系83-85
• 2.5 CRT膜转位相关机制研究85-96
• 3 讨论96-98
• 小结98-99
• 第一部分98
• 第二部分98-99
• 参考文献99-110
• 附录110-115
• 个人简历和研究成果115-118
• 个人简历115
• 博士研究生期间论文发表情况115-118
• SCI论文115-116
• 中文论文116
• 参与编写专著116-117
• 专利117-118
• 致谢118

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本文编号：995644