MiR29在铝致脑内Aβ沉积过程中的作用

发布时间：2017-10-08 14:23

  本文关键词：MiR29在铝致脑内Aβ沉积过程中的作用

  更多相关文章： 麦芽酚铝 Aβ沉积 BACE miR29 NF-κB

【摘要】：目的：1、通过动物体内实验,研究铝对大鼠脑内mi R29各亚型,BACE基因、蛋白及Aβ1-40和Aβ1-42的影响情况,筛选和分辨可能参与铝致脑内Aβ沉积过程的mi R29类型;2、通过细胞培养,确定mi R29通过影响BACE水平在铝引起脑内Aβ沉积过程中的作用机制;3、通过动物体内实验和细胞培养干预实验,探索mi R29调节铝致脑内Aβ沉积过程的上游机制。方法：1、取40只健康的,雄性的SD大鼠,按体重随机分为4组,生理盐水组(对照组),15μmol/kg BW组(低剂量组),30μmol/kg BW组(中剂量组)和45μmol/kg BW组(高剂量组),每组10只。采用腹腔注射的方式进行染毒两个月。染毒期结束后,采用石墨炉原子吸收法检测大鼠血铝、脑皮质和海马内铝含量;采用ELISA检测大鼠皮质和海马Aβ1-40,Aβ1-42的量;采用RT-PCR检测大鼠脑皮质和海马BACEm RNA,mi R29a,mi R29a*,mi R29b1,mi R29b2,mi R29c1,mi R29c2的表达水平;Western-blot检测大鼠脑皮质和海马中BACE蛋白,NF-κB的表达激活情况。并分析各型mi R29与BACE的关系,从中筛选出可能参与调节铝致脑内Aβ沉积作用的mi R29的类型。2、选择肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系(PC12)细胞进行体外培养,根据动物实验结果,采用脂质体转染技术将mi R29a mimics或者mi R29b1 mimics转染入细胞内,实验组分别分为空白对照组,未转染染毒组(包括100μmol/l麦芽酚铝组,200μmol/l麦芽酚铝组,400μmol/l麦芽酚铝组),转染阴性对照组和目的基因转染组,目的基因转染组再分为四组:对照组(给予磷酸盐缓冲液(PBS)),100μmol/l麦芽酚铝组,200μmol/l麦芽酚铝组,400μmol/l麦芽酚铝组。转染基因24小时后进行染毒,染毒后24小时收集细胞及细胞上液进行各项指标检测。采用CCK-8法测定细胞活力;RT-PCR检测BACEm RNA水平;ELISA检测BACE蛋白,Aβ1-40,Aβ1-42水平。3、依据动物体内实验结果,选择PC12细胞进行体外培养干预实验,将实验组分为对照组(给予PBS),PDTC100μmol/L组,200μmol/l麦芽酚铝组,200μmol/l麦芽酚铝+PDTC100μmol/l组。染毒和干预后24小时收集细胞及细胞培养液测定各项指标。采用CCK-8法测定细胞活力;RT-PCR检测mi R29a,mi R29b1,BACEm RNA水平;ELISA检测BACE蛋白水平,Aβ1-40,Aβ1-42水平。结果: 1、动物整体实验结果:(1)随着染毒剂量的不断增加,染毒剂量组大鼠血铝明显升高。低、中、高剂量组的血铝水平分别为(92.05±5.63)μg/l,(111.74±5.88)μg/l,(165.50±9.79)μg/l,较对照组(47.76±6.58)μg/l相比明显升高,差异有统计学意义(P0.05);脑皮质中铝含量在低、中、高剂量组(31.40±5.74)ng/g,(72.36±4.79)ng/g,(93.37±3.04)ng/g,较对照组(12.11±1.42)ng/g明显升高,差异有统计学意义(P0.05);大鼠脑海马中铝含量在低中高剂量组分别为(51.72±6.04)ng/g,(86.92±5.38)ng/g,(106.24±6.18)ng/g,较对照组(11.67±1.04)ng/g明显升高,差异均具有统计学意义(P0.05)。(2)随染毒剂量的增高,皮质和海马内Aβ总量(Aβ1-40和Aβ1-42总和)增高,与对照组相比,皮质内高剂量组Aβ总量增高有统计学意义(P0.05),在海马内中、高剂量组Aβ总量增高有统计学意义(P0.05);其中Aβ1-40变化不明显,在皮质和海马内各染毒组与对照组相比没有统计学意义(P0.05);而Aβ1-42有显著增高,与对照组相比,皮质内高剂量组增高有统计学意义(P0.05),海马内低、中、高剂量组Aβ1-42增高均有统计学意义(P0.05)。(3)随着染毒剂量的增高,皮质和海马内BACEm RNA,BACE蛋白成升高趋势。与对照组相比,在大鼠脑皮质内,低剂量组BACEm RNA,BACE蛋白增高没有统计学意义,中、高剂量组BACEm RNA和BACE蛋白增高均有统计学意义(P0.05);在大鼠脑海马内,BACEm RNA和BACE蛋白增高在各染毒剂量组均有统计学意义(P0.05)。且BACE蛋白与Aβ总量相关,(皮质中R=0.618,P0.01,海马中R=0.796,P0.01);BACE蛋白与Aβ1-42相关(皮质中R=0.608,P0.01海马中R=0.804,P0.01)。(4)mi R29a,mi R29a*,mi R29b1,miRb2,mi Rc1,mi Rc2均呈现降低趋势。在皮质和海马内,各染毒组mi R29a*,mi Rb2,mi Rc1,mi Rc2较对照组降低均有统计学意义(P0.01);但经过相关分析,在皮质内mi R29a*,mi Rb2,mi Rc1,mi Rc2均与BACEm RNA及BACE蛋白均无相关性(r=-0.238,-0.261,P0.05;r=-0.235,-0.238,P0.05;r=-0.216,-0.297,P0.05;r=-0.237,-0.296,P0.05),在海马内mi R29a*,mi Rb2,mi Rc1,mi Rc2均与BACEm RNA及BACE蛋白均无相关性(r=-0.332,-0.317,P0.05;r=-0.323,-0.317,P0.05;r=-0.404,-0.479,P0.05;r=-0.370,-0.353,P0.05)。在皮质和海马内,与对照组相比,mi R29a,mi R29b1低,中剂量组升高无统计学意义(P0.05),高剂量组升高有统计学意义(P0.05),且经过相关分析,在皮质内mi R29a与BACEm RNA及BACE蛋白均有显著相关性(r=-0.991,-0.987,P0.05),mi R29b1与BACEm RNA及BACE蛋白均有显著相关性(r=-0.969,-0.992,P0.05);在海马内mi R29a与BACEm RNA及BACE蛋白均有显著相关性(r=-0.963,-0.981,P0.05),mi R29b1与BACEm RNA及BACE蛋白均有显著相关性(r=-0.983,-0.991,P0.05)。(5)核蛋白NF-κB/P65在皮质和海马中呈升高趋势。在皮质和海马中,与对照组相比较,NF-κB/P65在低剂量组升高无统计学意义(P0.05),NF-κB/P65在中、高剂量组升高有统计学意义(P0.05)。2、细胞转染实验结果:mi R29a,mi R29b1转染后24h后,转染水平达到最高,目的基因转染组与转染阴性对照组比较,转染组mi R29a,mi R29b1水平可升高500倍左右。随后逐渐下降,72h后降至100倍水平左右。当转染组mi R29a,mi R29b1水平到达最高,即24h时,进行染毒,染毒后24h(转染后48 h)收集细胞核细胞上液进行实验。(1)各组细胞的形态学改变:对照组,转染阴性对照组、转染阳性对照组(转染目的基因mi R29a或mi R29b1,给予PBS组)细胞生长状态良好,细胞大小一致、均匀,贴壁良好,细胞密集,连接较多;转染低剂量组有少数死亡细胞,连接减少,其余变化不明显;转染中剂量组细胞状态稍有变差,细胞数量减少,细胞贴壁性变差,出现部分细胞皱缩呈圆形,连接减少;转染高剂量组细胞形态变化较为明显,数量进一步减少,较多细胞皱缩呈圆形,细胞贴壁不紧,细胞间连接极为松散。各未转染细胞状态较转染组细胞状态差。转染mi R29a,mi R29b1细胞形态表现相似。(2)细胞活力测定结果显示,对照组,转染阴性对照组、转染阳性对照组各组细胞活力无明显差别(P0.05),与对照组相比,未转染组随着染毒剂量的升高,细胞活力明显降低,与对照组相比,各组降低均有统计学意义(P0.05);转染染毒组与对照组相比,细胞活力有一定降低(P0.05),低、中剂量组无统计学意义(P0.05),高剂量组降低有统计学意义(P0.05);各相同染毒剂量组相比,转染组细胞活力较未转染组细胞活力明显回升(P0.05)。转染mi R29a,mi R29b1细胞活力结果相似。(3)各组细胞BACEmRNA,BACE水平的变化:空白对照组,转染阴性对照组BACEm RNA,BACE表达水平无明显差别(P0.05);与对照组相比,未转染组随着染毒剂量的升高,BACEm RNA,BACE明显升高(P0.05);转染组各组与对照组相比,BACEm RNA差异无统计学意义(P0.05),阳性对照组、转染低剂量组较空白对照组BACE水平降低,有统计学意义(P0.05),转染中、高剂量组BACE水平降低无统计学意义(P0.05);各相同染毒剂量组相比,转染组细胞中BACEm RNA,BACE较未转染组细胞BACEm RNA,BACE表达水平明显降低,且差异有统计学意义(P0.05)。转染mi R29a,mi R29b1细胞BACEmRNA,BACE表达水平结果相似。(4)各组细胞Aβ含量的变化:与空白对照组相比,各组Aβ总量有变化(P0.05),空白对照组,转染阴性对照组Aβ总量无明显差别(P0.05);转染阳性对照组Aβ总量较空白对照组水平出现降低(P0.05),与对照组相比,未转染组随着染毒剂量的升高,Aβ总量明显升高,与对照组相比,Aβ总量各组升高均有统计学意义(P0.05);转染染毒组与对照组相比,Aβ总量水平降低(P0.05),低剂量组有统计学意义(P0.05),中、高剂量组降低无统计学意义(P0.05);其中,与空白对照组相比,各组Aβ1-40含量有变化(P0.05),未转染中、高剂量染毒组较对照组Aβ1-40含量升高(P0.05),阳性转染对照组,转染低剂量组较空白对照组相比Aβ1-40含量明显降低(P0.05),转染中、高剂量染毒组较空白对照组Aβ1-40含量无明显差异(P0.05),各相同染毒剂量组相比,转染组细胞中Aβ1-40含量较未转染组细胞Aβ总量水平明显降低,且差异有统计学意义(P0.05);与空白对照组相比,各组Aβ1-42含量有变化(P0.05),空白对照组,转染阴性对照组Aβ1-42含量无明显差别(P0.05);与对照组相比,未转染组随着染毒剂量的升高,Aβ1-42含量出现明显升高(P0.05),转染阳性对照组、转染低剂量组Aβ1-42含量较空白对照组水平出现降低(P0.05),转染中、高剂量组Aβ1-42含量降低无统计学意义(P0.05);各相同染毒剂量组相比,转染组细胞中Aβ1-42含量较未转染组细胞Aβ1-42含量水平明显降低,且差异有统计学意义(P0.05);3、细胞干预实验结果(1)各组细胞形态学变化情况:对照组,100μmol/l PDTC组细胞生长状态良好,细胞大小一致、均匀,贴壁性良好,细胞密集,细胞凸起长而多,连接丰富紧密;200μmol/l麦芽酚铝组细胞状态较差,细胞数量减少,细胞贴壁性变差,出现部分细胞皱缩呈圆形,连接减少松散;200μmol/l麦芽酚铝+100μmol/l PDTC组细胞状态转好,细胞凸起增多,连接增加且密集型也增加。(2)各组细胞活力变化情况:各组细胞细胞活力有差异(P0.05);对照组,100μmol/l PDTC组细胞活力无明显差异(P0.05),与对照组相比,200μmol/l麦芽酚铝组细胞活力明显降低(P0.05);200μmol/l麦芽酚铝+100μmol/l PDTC组细胞活力较200μmol/l麦芽酚铝组升高(P0.05),但较对照组低(P0.05)。(3)各组细胞mi R29a,mi R29b1水平:各组细胞中mi29a表达有差异(P0.05);与对照组相比,100μmol/l PDTC组细胞中mi R29a表达有升高,差异有统计学意义(P0.05),200μmol/l麦芽酚铝组细胞中mi R29a表达明显降低(P0.05);200μmol/l麦芽酚铝+100μmol/l PDTC组细胞中mi R29a较200μmol/l麦芽酚铝组升高(P0.05),但较对照组低(P0.05)。各组细胞中mi R29b1有差异(P0.05);与对照组相比,100μmol/l PDTC组细胞mi R29b1表达有升高,差异有统计学意义(P0.05),200μmol/l麦芽酚铝组细胞中mi29b1明显降低(P0.05);200μmol/l麦芽酚铝+100μmol/l PDTC组细胞中mi29b1较200μmol/l麦芽酚铝组升高(P0.05),但较对照组低(P0.05)。(4)各组细胞BACEm RNA,BACE水平的变化:各组细胞中BACEm RNA有差异(P0.05);与对照组相比,100μmol/l PDTC组细胞中BACEm RNA表达有降低,但没有统计学意义(P0.05),200μmol/l麦芽酚铝组细胞中BACEm RNA表达明显升高(P0.05);200μmol/l麦芽酚铝+100μmol/l PDTC组细胞中BACEm RNA较200μmol/l麦芽酚铝组降低,但无统计学差异(P0.05)。各组细胞中BACE有差异(P0.05);与对照组相比,100μmol/l PDTC组细胞BACE表达有降低,差异有统计学意义(P0.05),200μmol/l麦芽酚铝组细胞中BACE明显升高,200μmol/l麦芽酚铝+100μmol/l PDTC组细胞中BACE较200μmol/l麦芽酚铝组降低(P0.05),但较对照组高(P0.05)。(5)各组细胞染毒后Aβ含量的变化:各组细胞中Aβ总量有差异(P0.05);与对照组相比,100μmol/l PDTC组细胞中Aβ总量有降低(P0.05),200μmol/l麦芽酚铝组细胞中Aβ总量明显升高(P0.05);200μmol/l麦芽酚铝+100μmol/l PDTC组细胞中Aβ总量较200μmol/l麦芽酚铝组降低(P0.05),但较对照组高(P0.05)。其中Aβ1-40含量在各组细胞中有差异(P0.05);与对照组相比,100μmol/l PDTC组细胞Aβ1-40含量有降低,但没有统计学意义(P0.05),200μmol/l麦芽酚铝组细胞中Aβ1-40含量明显增加(P0.05);200μmol/l麦芽酚铝+100μmol/l PDTC组细胞中Aβ1-40含量较200μmol/l麦芽酚铝组降低(P0.05),但较对照组高(P0.05)。各组Aβ1-42有变化(P0.05),与对照组相比,100μmol/l PDTC组细胞Aβ1-42含量降低(P0.05),200μmol/l麦芽酚铝组细胞中Aβ1-42含量明显增加(P0.05);200μmol/l麦芽酚铝+100μmol/l PDTC组细胞中Aβ1-42含量较200μmol/l麦芽酚铝组降低(P0.05),但较对照组高(P0.05)。结论：1、麦芽酚铝可以提高大鼠血铝和脑铝水平,在脑皮质和海马中蓄积均比较明显。2、麦芽酚铝可以引起大鼠脑皮质和海马内Aβ1-42沉积,其机制可能与铝可以降低mi R29a,mi R29b1水平,从而引起大鼠脑内BACEm RNA,BACE水平升高有关。3、铝可能通过影响脑内NF-κB从而影响大鼠脑内mi R29水平。
【关键词】：麦芽酚铝 Aβ沉积 BACE miR29 NF-κB
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R135.1
【目录】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-18
• 常用缩写词中英文对照表18-20
• 前言20-25
• 第一部分 铝对大鼠脑内miR29、BACE和Aβ 的影响25-54
• 1 材料与方法25-36
• 1.1 实验材料25-27
• 1.2 实验方法27-36
• 1.3 统计分析方法36
• 2 结果36-49
• 2.1 实验动物基本情况36-38
• 2.2 染铝大鼠血铝、脑皮质和海马铝水平38-40
• 2.3 染铝大鼠脑皮质和海马内Aβ 的水平40-43
• 2.4 染铝大鼠脑皮质和海马内BACEm RNA和BACE蛋白表达的变化43-45
• 2.5 染铝大鼠脑皮质和海马内miRNA29的表达45-49
• 3 讨论49-53
• 4 结论53-54
• 第二部分 Mi R29a, b1调控BACE在铝致Aβ 沉积过程中的机制54-78
• 1 材料与方法54-60
• 1.1 实验材料54-56
• 1.2 实验方法56-60
• 1.3 统计分析方法60
• 2 结果60-75
• 2.1 转染后不同时点miR29a, miR29b1的表达情况60-62
• 2.2 各组细胞的形态学变化62-64
• 2.3 各组细胞活力的变化64-65
• 2.4 各组细胞染毒后BACEm RNA和BACE水平的变化65-69
• 2.5 各组细胞染毒后Aβ 的含量的变化69-75
• 3 讨论75-77
• 4 结论77-78
• 第三部分 NF-κB在miR29a, b1调节铝致脑内Aβ 沉积过程的作用78-93
• 1 材料与方法79-82
• 1.1 实验材料79-80
• 1.2 实验方法80-82
• 1.3 统计分析方法82
• 2 结果82-89
• 2.1 大鼠脑皮质和海马中NF-κB/p65表达的变化82-83
• 2.2 各组细胞形态学变化情况83-84
• 2.3 各组细胞活力的变化84-85
• 2.4 各组细胞miR29a, miR29b1的变化85-86
• 2.5 各组细胞BACEm RNA和BACE水平的变化86-87
• 2.6 各组细胞Aβ 的含量的变化87-89
• 3 讨论89-92
• 4 结论92-93
• 总结93-94
• 参考文献94-101
• 综述101-116
• 综述参考文献109-116
• 致谢116-118
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果118-119
• 个人简历119

【参考文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 王林平;铝致大鼠海马神经细胞凋亡分子机制的体内实验研究[D];山西医科大学;2005年

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本文编号：994520