致病性维氏气单胞菌CL0901株菌蜕对鲤免疫功能和hepcidin基因表达影响研究

发布时间：2018-04-10 19:22

本文选题：维氏气单胞菌菌蜕 + 鲤(Cyprinus　；参考：《上海海洋大学》2017年硕士论文

【摘要】：细菌性疾病作为水产动物疾病主要类型,对水产养殖业造成巨大损失,同时一些人兽共患病原菌潜在威胁着人类健康。维氏气单胞菌CL0901株是发病锦鲤体内分离的一株革兰氏阴性杆菌,具有较强致病性,感染鱼体表出现溃疡,病变部位鳞片脱落,肌肉外露等症状。目前针对细菌性疾病的化学方法和抗生素治疗存在着很多弊端,相比之下疫苗接种是较安全有效手段,因此很多学者对用疫苗来提高水产动物免疫力进行了大量探索。而在诸多疫苗中,菌蜕是革兰氏阴性菌被噬菌体PhiX174裂解基因E的产物裂解后形成的完整细菌空壳,在灭活过程中与传统的甲醛灭活苗比较,保留了完整细胞形态和表面抗原并且兼具一些佐剂的性质,能够直接刺激鱼体免疫反应,使其成为新型疫苗重要候选者,但其研究偏重构建方面,为推动此种疫苗发展和推广,对其接种后引起水产动物免疫效应研究十分必要,查阅大量文献发现,多数学者对水生动物接种疫苗后免疫效应机制探讨都从特异性免疫即抗体效价和免疫保护率着手,对非特异性免疫反应及更深层次免疫相关基因研究很少。为了更全面了解菌蜕疫苗对水产动物免疫效应,本研究用制备的致病性维氏气单胞菌CL0901株菌蜕接种鲤,在实验条件下研究了免疫菌蜕后鲤(Cyprinus carpio)特异性、非特异性免疫指标及hepcidin基因表达量的变化,综合探讨维氏气单胞菌菌蜕对鲤免疫的影响,进一步为菌蜕疫苗在引起鱼类免疫保护途径和效果方面提供一些科学参考。本论文主要研究内容和结果如下:实验条件下培养含有裂解基因E重组质粒pBBR1MCS2-E的重组维罗纳气单胞菌CL0901株,在42℃诱导裂解基因E表达12-16小时,收集菌蜕。在开始实验的第1、15和29天使用菌蜕疫苗(CLGs)和甲醛灭活疫苗(FKC)对鲤进行注射3次免疫,并设一个注射PBS的对照组,每个组设3个重复。从第一次免疫后每隔7 d从每个重复中随机取三尾鱼进行取样,最后进行攻毒实验。对血清抗体滴度、相对免疫保护率(RPS)、溶菌酶(LZM)、呼吸爆发、补体C3、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(ALP)及hepcidin基因表达量进行测定。(1)采用凝集抗体效价方法测定免疫维氏气单胞菌CL0901株菌蜕后鲤血清不同时间抗体效价变化,并对取样后的受免鱼体进行攻毒实验,观察死亡情况测定相对免疫保护率RPS,发现菌蜕组抗体凝集效价在免疫后35天达26-28,显著高于FKC和PBS组(P0.05),并能维持一定时间;而且CLGs组的RPS为57.70%、FKC组RPS为30.77%。表明免疫菌蜕能够有效提升抗体水平并能起到良好免疫保护作用。(2)用NBT法测定不同实验组免疫鱼体呼吸爆发作用并用相应的试剂盒测定血清中相关免疫酶类活性。结果显示二次免疫后,CLGs组呼吸爆发、LZM、MPO含量显著高于PBS组(P0.05),MDA含量显著低于PBS组(P0.05);CLGs组C3含量在35和42 d显著低于PBS组(P0.05);ALP含量显著低于FKC组和PBS组(P0.05);SOD含量在7、28、42天显著低于PBS组(P0.05);可以看出维氏气单胞菌CL0901株菌蜕免疫的鲤,其非特异免疫在二次免疫后部分得到显著增强。(3)采用实时荧光定量的方法测定免疫相关基因表达量。免疫菌蜕后抗菌肽hepcidin基因表达主要发生在肝脏,脾脏次之,头肾中最低,其中头肾中CLGs组的hepcidin基因表达量在21天显著高于FKC和PBS组(P0.05);肝脏和脾脏中CLGs组的hepcidin基因表达量在28天均显著高于FKC和PBS组(P0.05)。综合分析维氏气单胞菌菌蜕在免疫鲤时二次免疫后到免疫28天,机体呼吸爆发作用提高,血清溶菌酶、髓过氧化物酶含量大幅度提升,hepcidin基因表达量显著提高,执行非特异性免疫,对侵入机体病原菌进行清除,免疫35天后有血清特异性抗体效价显著升高发挥特异性免疫作用;且菌蜕在提升血清抗体水平、呼吸爆发作用、溶菌酶、髓过氧化物酶含量及hepcidin基因表达量作用强于甲醛灭活苗。
[Abstract]:In order to understand the effect of the vaccine on the immune response of aquatic animals , it is very necessary to study the specific , non - specific immune index and the effect of the vaccine . The results are as follows : In order to better understand the immune response of the vaccine to aquatic animals , it is very necessary to study the immune response mechanism of the vaccine . ( 1 ) The antibody titer of CLGs group was significantly higher than that in PBS group ( P0.05 ) , and the level of serum lysozyme and MPO was significantly higher than that in PBS group ( P0.05 ) .

【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S948

【参考文献】