猪ELF4的克隆及其在诱导IFN-β中的作用研究

发布时间：2018-04-22 16:52

本文选题：ELF4(E74-like + factor　；参考：《华中农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：天然免疫系统是机体抵御病原微生物侵入的重要屏障,也是机体获得适应性免疫反应的基础。I型干扰素(IFN-I)的产生和分泌是天然免疫应答的一个很重要的方面,其主要包括IFN-α和IFN-β。本课题将猪抗病毒天然免疫信号通路作为切入点,克隆了该通路中的关键分子E74样因子4(po ELF4)基因,并对其在IFN-β信号通路中的功能进行了深入研究。主要研究内容如下:1.猪ELF4基因的克隆、序列分析及组织表达差异分析以提取的PK-15 RNA反转录的c DNA为模板,首次克隆得到了po ELF4基因,该基因开放读码框全长为1989bp,编码662个氨基酸。同源序列比对发现po ELF4与人ELF4(hu ELF4)基因同源性高达91.57%,与鼠ELF4的同源性为78.58%。进化树分析表明po ELF4在进化上单独属于一个分支。组织表达差异显示po ELF4在猪胃、小肠和淋巴中的表达量比较高,并以小肠中的表达量最高。2.猪ELF4参与激活IFN-β信号通路抗病毒天然免疫信号通路中的许多关键分子参与激活IFN-β信号通路。将po ELF4真核表达质粒分别与猪源IFN-β启动子荧光素酶报告质粒IFN-β-luc、猪源IRF3荧光素酶报告质粒IRF3-luc以及内参质粒海参荧光素酶报告质粒p RL-TK共转染至猪小肠粘膜上皮细胞(SIEC)、猪肾细胞(PK-15)、猪肾上皮细胞(IBRS-2),双荧光素酶检测显示po ELF4能显著激活IFN-β-luc和IRF3-luc,并呈现剂量依赖。核定位实验表明,超表达po ELF4不能促进IRF3入核。3.猪ELF4激活IFN-β的功能域分析根据软件预测po ELF4有8个结构域,因而构建了8个缺失突变体。双荧光素酶实验显示分别缺失NLS、ETS、53-86(Acidic domain)和T2B区域以后,po ELF4激活IFN-β的能力下降,而缺失其它区域没有影响,说明NLS、ETS、53-86(Acidic domain)和T2B区域是猪ELF4激活IFN-β的关键结构域。有文献报道hu ELF4缺失360-347(Serine/threonine rich domain)区域后不能诱导干扰素产生,主要是因为该区域缺失后hu ELF4不能被磷酸化,进而不能入核。核定位实验显示po ELF4缺失NLS区域后定位于细胞浆,而缺失306-347(Serine/threonine rich domain)区域后依然能够入核,提示其可能存在其它的磷酸化位点。4.猪ELF4参与Se V、poly(I:C)、poly(d A:d T)诱导的IFN-β产生以po ELF4的干扰分子转染PK-15细胞,利用IFN-β启动子荧光素酶报告质粒检测了内源性po ELF4对Se V、poly(I:C)、poly(d A:d T)诱导的IFN-β产生的影响,结果显示干扰内源性po ELF4后显著抑制由Se V、poly(I:C)、poly(d A:d T)诱导的IFN-β产生,并呈剂量依赖性,说明po ELF4参与Se V、poly(I:C)、poly(d A:d T)诱导的IFN-β产生。5.猪ELF4对病毒增殖的影响及病毒感染对猪ELF4表达的影响为了分析po ELF4对病毒增殖的影响,以PRV和PRRSV分别作为DNA病毒和RNA病毒的代表,在细胞中超表达或干扰po ELF4,通过TCID50检测或结合PFU检测、荧光定量PCR和Western blot检测,证实po ELF4对PRV和PRRSV增殖有显著的抑制作用。此外,在体外细胞培养中,PRRSV感染、Se V感染及poly(I:C)和poly(d A:d T)刺激均能够促进po ELF4的表达,但PRV感染对po ELF4的表达影响不显著。
[Abstract]:The expression of IFN - 尾 - luc in pig stomach , pig kidney cells ( PK - 15 ) , porcine kidney epithelial cells ( IBRS - 2 ) were studied . IFN - 尾 induced by Se V , poly ( I : C ) and poly ( d A : d T ) was detected by using IFN - 尾 promoter luciferase reporter plasmid . In vitro cell culture , the infection , Se V infection and poly ( I : C ) and poly ( d A : d T ) stimulated the expression of po ELF4 , but the effect of PRV infection on the expression of po ELF4 was not significant .

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.4

【参考文献】