IgG2σ Fc融合蛋白的真核表达与生物活性鉴定

  本文关键词：对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26与细胞穿膜肽的融合蛋白在毕赤酵母中的组成型表达研究，由笔耕文化传播整理发布。

《安徽医科大学》 2016年

长效GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的真核表达与生物活性鉴定

杨懿  

【摘要】：GLP-1(Glucagon-like peptide-1,胰高血糖素样肽)是一种由胰高血糖素原基因翻译表达的一种31个氨基酸的多肽,它通过与相应的G蛋白偶联受体结合发挥生物效应。GLP-1可以显著的提高一、二相胰岛素分泌,降低胰高血糖素水平,并延缓胃排空,因为GLP-1降低血糖的效应具有血糖依赖性并且具有降低体重的作用,故GLP-1作为二型糖尿病的治疗药物时可以有效的避免低血糖的发生并缓解肥胖所造成的胰岛素耐受。由于体内二肽基肽酶对于GLP-1的特异性酶切和小分子多肽固有的高肾清除率,GLP-1体内半衰期仅仅为2分钟。当前研究主要采用对GLP-1氨基酸位点修饰、替换和连接大分子蛋白的方法来为了延长GLP-1的半衰期。具有代表性的GLP-1类似物有Exenatide(艾塞那肽)、Liraglutide(利拉鲁肽)和Dulaglutide (杜拉鲁肽)。本课题中将GLP-1变体(A8G/G26E/R36G)通过肽链Linker连接在IgG2σ的Fc段上。利用CHO-K1甫乳动物细胞表达平台构建并表达了GLP-1 IgG2σFc融合蛋白。通过初步亲和层析获得了纯度较高的重组融合蛋白,并在体内和体外水平对GLP-1 Fc融合蛋白进行了生物活性鉴定。第一部分构建GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的表达质粒并筛选出稳定表达GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的CHO-K1稳定细胞株本部分研究将设计合成的GLP-1 IgG2σ Fc融合蛋白编码序列(cDNA,918bp)使用T4连接酶酶连入哺乳细胞表达载体SGLs载体中(7956bp),并通过测序确认表达载体构建成功(引物5'-CAGGACCACGTCGTGCCAGT-3')。在使用PvuI酶对表达载体酶切后,使用电穿孔转染的方式将线性化表达载体稳定转染至CHO-K1细胞中,使用蛋白凝胶电泳和间接法ELISA对细胞培养上清进行检测,筛选出高表达细胞株。经过三轮的亚克隆筛选最终获得的细胞株蛋白表达水平达到1.2g/L。通过对连续培养的细胞上清进行检测,并根据目标蛋白表达水平和杂质含量变化,在细胞连续培养12天后收获培养上清。该部分研究成功构建了GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的表达质粒,构建并筛选出融合蛋白的稳定表达细胞株,为后续实验提供了物质基础。第二部分建立GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的纯化方法并对融合蛋白进行鉴定分析本部分研究的目的为探究从细胞培养上清中获得纯度较高融合蛋白的纯化方法,并鉴定产物是否为目标产物。首先通过离心收集细胞连续培养12天后的细胞上清,使用Protein A亲和层析柱进行亲和层析,由于亲和层析后的蛋白仍然含有降解产物和多聚体,因此进一步进行疏水层析,经两步纯化获得的融合蛋白,经HPLC分析和SDS-PAGE分析,显示蛋白纯度高于90%。分别以抗GLP-1抗体和抗IgG Fc抗体为检测抗体,对纯化获得的GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白进行Western-blotting检测,验证了融合蛋白的完整性。第三部分GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的生物活性的体内外研究本部分内容中,首先通过INS-1细胞中进行了GSIS(葡萄糖刺激胰岛素分泌试验),胰岛素ELISA测定证实GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白在高糖条件下可以促进胰岛素的分泌;同时通过荧光定量PCR检测胰岛素mRNA,也证实了融合蛋白具有促进胰岛素mRNA合成的作用。随后,通过C57/BL6J小鼠OGTT试验,一方面确定融合蛋白具有降血糖作用,一方面初步确立了给药剂量。在自发性肥胖糖尿病模型KKAy小鼠体内进行为期四周(给药频率为每三天给药一次)的实验,与阳性对照药GLP-1-IgG4 Fc融合蛋白相比,GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白显示出更为出色的降血糖作用以及体重控制效能。最后在食蟹猴体内进行了的半衰期测定试验,单次给药0.1 mg/kg后,GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的半衰期为57.1小时,与Dulaglutide同实验体系下的半衰期(38小时)相比,延长了约50%,初步验证了融合蛋白在保持GLP-1药效的同时,因融合低免疫活性IgG2σ Fc而获得更长半衰期的设计理念。综上所述,本课题成功构建了稳定表达GLP-1-IgG2σFc融合蛋白的高表达稳定细胞株,经纯化制备了重组GLP-1-IgG2σFc融合蛋白,并考察了重组蛋白的体内、外生物活性。结果表明重组GLP-1-IgG2σFc融合蛋白具备持久的降血糖作用、半衰期长及出色的体重控制能力,值得进一步开发成为新的糖尿病治疗药物。

【关键词】：
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

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