胭脂鱼CD79a和CD79b基因的克
发布时间：2018-12-12 13:01
【摘要】：胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)属鲤形目(Cypriniformes)胭脂鱼科(Catostomidae),仅分布于我国长江和闽江,为我国也是亚洲特有的物种。同时,其肉质鲜美,在水产养殖上具有重要的经济价值。近年来,由于环境的破环、过度捕捞,加之性成熟较晚,胭脂鱼的数量逐渐减少,现已被列为我国国家二级水生野生保护动物。人工养殖是恢复胭脂鱼资源的重要途径,但在养殖过程中死亡率却居高不下。目前,对该问题的研究还停留在人工水质、投喂饲料、病原体感染等对其高死亡率的影响。本研究试图从其免疫系统基础研究入手,希望为解决胭脂鱼人工繁殖中所存在的问题及疾病预防提供理论依据。适应性免疫系统是机体抵御病原体入侵的重要机制,研究表明:鱼类是最早具有适应性免疫系统的低等脊椎动物,在免疫系统进化研究中占有特殊地位。因此,对鱼类免疫系统的研究能为脊椎动物免疫系统的进化规律提供一定的理论基础。在免疫系统中,B淋巴细胞介导的体液免疫通过浆细胞产生抗体来消灭抗原,位于B细胞表面的抗原受体辅助分子CD79a和CD79b在抗原刺激信号的转导过程中发挥重要作用。此外,CD79a蛋白存在于B细胞的整个生命历程且不存在于其它健康细胞,故被视为B细胞的标志分子。然而,目前关于B细胞抗原受体辅助分子在硬骨鱼类中的研究甚少,仅在斑点叉尾洶和石斑鱼中有相关报道。本文通过同源比对和cDNA末端快速扩增的方法,获得胭脂鱼B细胞抗原受体辅助分子CD79a和CD79b序列。其中CD79a的cDNA全长1059 bp,5’非编码区包含33 bp,3’非编码区包含348 bp含有加尾信号(AATAAA),开放阅读框包含678 bp编码225个氨基酸。CD79b的cDNA长为801 bp,5’非编码区包含165 bp,开放阅读框包含636 bp编码211个氨基酸。多序列比对结果表明两者均由信号肽、免疫球蛋白样区、跨膜区和富含酪氨酸活化基序胞的质区组成,同时,用于形成域内二硫键的半胱氨酸残基也非常保守。进化树结果显示胭脂鱼的CD79a和CD79b分别与斑马鱼和鲤鱼的CD79a和CD79b聚为一枝。发育时期RT-PCR结果表明:CD79a和CD79b在胭脂鱼的受精卵中即可检测到,但表达量极其微弱,至出膜后30天左右的时候,CD79a和CD79b表达量趋于稳定并逐渐增多。各组织RT-PCR结果表明:CD79a和CD79b在脾脏中表达量最高,头肾、肾和外周血次之,心脏、鳃和肝中表达量较少,在肠、脑、皮肤和肌肉中未检测到表达。灭活嗜水气单胞菌刺激胭脂鱼后,Q-PCR结果表明:CD79a和CD79b在头肾中的变化最显著,在所有时间点都检测到有上升趋势,其中在48h、72 h、96 h和7 d时表达水平显著升高(P0.05㖞。在脾脏中的变化趋势较头肾弱,CD79a和CD79b的表达量主要在48 h、72 h和96 h检测到上调。在肾中的变化最弱,CD79a和CD79b主要在48 h、72 h、96 h和7 d检测到有微弱的上调。对外周血白细胞,脾脏、头肾、肾、肠道、鳃和皮肤组织切片的原位杂交结果显示:少量CD79a,CD79b和IgM阳性细胞在外周血中细胞可以检测到。在脾脏、头肾和肾中,CD79a,CD79b和IgM阳性细胞较多,以分散或聚集的形式分布在整个器官中。在肠道中,CD79a、CD79b和IgM的分布有所差异,CD79a和CD79b阳性细胞主要分布在后肠的固有层中,少量分布于上皮细胞中,在前肠和中肠中未检测到阳性信号。而IgM阳性信号主要集中在前肠和中肠的固有层中,后肠固有层中较少。除此之外,IgM阳性信号还可以在后肠上皮层和中肠的浆膜层中检测到表达。在鳃中,CD79a、CD79b和IgM阳性信号主要在鳃上皮细胞中检测到表达。在皮肤中未检测到阳性信号。通过原核表达载体PET-28a和PET-16b-GFP分别构建了CD79a和CD79b重组质粒,转化至大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,纯化得到重组蛋白。SDS-PAGE结果显示:CD79a重组蛋白主要以包涵体形式表达,分子量大小约为30 KDa,CD79b重组蛋白主要以分泌形式表达,分子量大小约为55 KDa。分别以CD79a和CD79b重组蛋白作为抗原,免疫5-6周龄Balb/c雌性小鼠和新西兰大白兔得到相应抗血清,并通过细胞融合的方法制备了能分泌CD79a单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1-A5B1、1-D12H10和1-C5A4。Western blotting结果显示:该抗体均可以与胭脂鱼的头肾提取液中分子量为25 KDa的蛋白发生特异性反应。本研究获得胭脂鱼CD79a全长cDNA序列和CD79b部分cDNA序列,分析了两者的表达模式,构建载体,体外表达目的蛋白并制备了相应的抗体,为进一步研究BCR辅助分子的结构、功能及在信号转导过程中如何发挥作用奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S965.126;Q78
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S965.126;Q78
【参考文献】
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本文编号：2374603
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