桔小实蝇注射法RNAi效率提升方法的研究

发布时间：2018-12-28 11:43

【摘要】：双链RNA(dsRNA)介导的RNA干扰(RNAi,RNA interference)技术通过dsRNA诱导序列特异性转录后基因沉默,已成为昆虫基因功能研究的重要手段,在害虫防治领域亦具有潜在的应用价值。一些研究表明,昆虫通过胞吞作用吸收dsRNA,H_2O_2能提升细胞对dsRNA的吸收;脂质体保护dsRNA,克服与细胞膜之间的静电斥力进入细胞;壳聚糖与dsRNA形成的纳米颗粒可以有效保护dsRNA,提升对dsRNA的转运能力。同时,高温、低温、大肠杆菌等诱导可引起RNAi通路相关基因诸如Dicer-2、Ago-2和R2D2等的表达上调,从而激活RNAi。目前,对桔小实蝇进行RNAi多采用注射法和饲喂法,而dsRNA介导的RNAi在双翅目昆虫普遍存在沉默效率不高、持效性差等问题。据此,本学位论文选取桔小实蝇3个不同类型的基因,包括组成性表达的肌动蛋白基因Actin-2、脂肪体和马氏管特异性高表达的羧酸酯酶基因CarE-6以及在中枢神经系统高表达的神经肽基因Natalisin,对桔小实蝇注射添加不同介质的dsRNA以及桔小实蝇经高低温或E.coli诱导处理后注射dsRNA,采用RT-qPCR技术检测3个基因的RNAi效率,通过分析获得提高不同类型基因RNAi效率的技术方案,为基于注射法的RNAi技术研究桔小实蝇基因的功能提供技术基础。主要结果如下:1、三种介质对桔小实蝇RNAi效率的时间效应在1.5μg 4000 ng/μL的dsRNA中分别添加H_2O_2(100 nL,质量分数5%)、Lipofectamine RNAimax(dsRNA与其质量体积比4:1)和Chitosan(质量体积比浓度0.02%)后对桔小实蝇进行混合注射,采用RT-qPCR技术检测靶标基因在注射后12 h、24 h、48 h和72 h的RNAi效率。结果表明,添加3种介质后,不同基因在不同检测时间点的RNAi效率存在差异。其中,添加H_2O_2后,Actin-2在72 h的RNAi效率得到提升,CarE-6在48 h的RNAi效率得到提升,Natalisin在12h、24h和48h的RNAi效率得到提升,但与单独注射dsRNA相比较差异不显著。添加Lipofectamine RNAimax后,Actin-2在48 h的RNAi效率提升,CarE-6在48 h和72 h的RNAi效率得到提升,Natalisin在48 h的RNAi效率得到显著提升,在72 h的RNAi效率得到提升。添加Chitosan后,Actin-2在48 h和72 h的RNAi效率得到提升,CarE-6在72 h的RNAi效率得到提升,Natalisin在48 h的RNAi效率得到显著提升,在72 h的RNAi效率提升。说明添加H_2O_2、Lipofectamine RNAimax或壳聚糖可以提升桔小实蝇RNAi的效率。基于以上检测结果,在后续条件优化中,分别选取在注射dsActin 72 h、dsCarE 48 h和dsNatalisin 24 h后进行各基因RNAi效率的分析。注射不同剂量的dsRNA(0.5μg、1μg和1.5μg)后,3个基因的RNAi效率呈现dsRNA剂量依赖性,剂量越大,RNAi效率越高。2、三种介质对桔小实蝇RNAi效率的剂量效应在1.5μg 4000 ng/μL的dsRNA中分别添加不同剂量的H_2O_2、Lipofectamine RNAimax和Chitosan后对桔小实蝇进行混合注射,采用RT-qPCR技术检测靶标基因的RNAi效率。结果表明,对桔小实蝇注射dsRNA+H_2O_2(100 nL,质量分数5%),3个基因的RNAi效率均有所提升,但差异不显著;注射dsRNA+H_2O_2(100 nL,质量分数10%和15%)后,RNAi效率均有所下降。说明注射在H_2O_2质量分数为5%时可以提升对靶标基因的RNAi效率,但不作为首选技术方案。对桔小实蝇注射dsRNA+Lipofectamine RNAimax(质量体积比2:1)后,3个基因的RNAi效率均显著提升,该方案可作为桔小实蝇基于注射法的RNAi优选方案。对桔小实蝇注射dsRNA+Chitosan后均能不同程度地提高对靶标基因的RNAi效率。其中,dsActin添加Chitosan(质量体积比浓度为0.08%)能够显著提升RNAi效率,添加3个浓度的壳聚糖均能显著提升对靶标基因CarE-6的RNAi效率,当dsNatalisin添加Chitosan(质量体积比浓度为0.02%、0.04%)时,能显著提升对靶标基因Natalisin的RNAi效率。基于RNAi效率与成本考虑,对于组织特异性高表达的基因CarE-6和Natalisin选择添加质量体积比浓度为0.02%的Chitosan,对于组成性表达的基因Actin-2选择添加质量体积比浓度为0.08%的Chitosan,以便获得最佳的RNAi效果。3、E.coli或高低温处理对桔小实蝇RNAi效率的影响对桔小实蝇注射不同体积的E.coli(OD600=1.0,100 nL、200 nL、400 nL)12h后,注射1.5μg 4000 ng/μL dsRNA,RT-qPCR分析结果显示,100 nL E.coli+dsActin、100 nL/200 nL E.coli+dsCarE以及200 nL E.coli+dsNatalisin处理后,对3个基因的RNAi效率无显著提升。200 nL/400 nL E.coli+dsActin、400nL E.coli+dsCarE以及100 nL/400 nL E.coli+dsNatalisin处理后,RNAi效率均有所降低。因此,E.coli诱导桔小实蝇不能有效提升对靶标基因的RNAi效率。分别将桔小实蝇置于低温12℃和高温42℃处理30 min后注射dsRNA,27℃条件下注射dsRNA为对照。RT-qPCR结果显示,与对照相比,高温或低温处理桔小实蝇会降低对靶标基因的RNAi效率。因此,在室温27℃条件下进行基于注射法的RNAi,能够获得较好的RNAi效率。综上所述,针对不同类型的基因,为实现对靶标基因的有效干扰,明确基因功能,推荐如下RNAi方案:(1)组成性表达的基因,27°C下,1.5μg 4000 ng/μL的dsRNA,混合注射dsRNA+Lipofectamine RNAimax(质量体积比2:1),或混合注射dsRNA+Chitosan(质量体积比浓度0.08%),注射后48 h-72 h检测表型。(2)脂肪体和马氏管特异性表达的基因,27°C下,1.5μg 4000 ng/μL的dsRNA,混合注射dsRNA+Lipofectamine RNAimax(质量体积比2:1),或者混合注射dsRNA+Chitosan(质量体积比浓度0.02%),注射后48 h-72 h检测表型。(3)中枢神经系统特异性表达的基因,27°C下,1.5μg 4000 ng/μL的dsRNA,混合注射dsRNA+Lipofectamine RNAimax(质量体积比2:1),或者混合注射dsRNA+Chitosan(质量体积比浓度0.02%),注射后12 h-72 h检测表型。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S433

【参考文献】

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本文编号：2393893