拟穴青蟹SpALF6和SpALF7的克

发布时间：2019-01-24 19:12

【摘要】：抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor,ALF)是甲壳动物体内主要的抗菌肽分子,属于阳离子抗菌肽家族。该家族抗菌肽具有序列和功能多样性的特点,在抗细菌、真菌、病毒等免疫反应中发挥重要作用。目前,对于该类抗菌肽如何通过序列的多样性影响其功能的多样性,仍缺乏足够的了解。本研究论文从拟穴青蟹体内鉴定了2种非典型的抗脂多糖因子成员,通过序列分析和功能研究,初步阐明了ALF家族成员序列多样性和其免疫功能的关系,揭示了序列多样性对功能多样的性的影响规律。我们研究首先从拟穴青蟹体内鉴定了SpALF6及其变异体SpALF6-V。与该家族大多成员蛋白属于阳离子抗菌肽不同,SpALF6的pI值为6.79,其LPS结合结构域LBD(LPS-binding domain)pI值为6.05,属于非典型的ALF家族成员,而其自然界中变异体SpALF6-V的pI值却为7.98,属于阳离子抗菌肽。生物信息学分析发现,这个变异体的产生是源于特定位点单核苷酸多态性(SNP)。为了研究SNP位点的存在对蛋白质功能的影响,我们对这两个蛋白质进行生物信息学分析,发现这两个氨基酸的突变分别是SpALF6成熟肽的LBD附近带正电荷组氨酸突变成高电荷精氨酸(H46突变为R),远离LBD的丙氨酸突变成了脯氨酸(A110突变为P)。由于丙氨酸和脯氨酸都不带电荷,而且远离LPS结合域,因此我们认为突变体SpALF6-V与SpALF6的性质功能上的差异可能是由组氨酸的突变导致的,因此为了研究这两种抗菌肽功能上的差异,我们通过人工定点突变的技术仅将组氨酸突变成了精氨酸获得了SpALF6的人工突变体来模拟SpALF6-V的功能,命名为SpALF6-M。首先我们进行了SpALF6在体内组织分布和表达模式研究。随后我们进行了SpALF6、SpALF6-M体外抑菌实验,细菌结合实验以及微生物表面主要病原相关分子模式结合实验比较研究。此外,我们也人工合成了SpALF6的LBD肽对其保守区进行了抑菌活性和微生物表面多糖结合研究。组织分布和表达模式研究结果表明,SpALF6主要是在血淋巴中表达,副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌免疫刺激青蟹后可以导致SpALF6的上调表达,暗示SpALF6可能参与到了抑菌免疫应答。与SpALF6相比,SpALF6-M表现出了更强抗革兰氏阳性菌和真菌作用以及细菌结合活性。同时,SpALF6-M也表现出了更强的LTA的结合活性,暗示SpAFL6-LBD外部且距离该结构域较近的特定氨基酸的能协助增强蛋白的抗菌作用。SpAFL6-LBD肽的功能研究结果表明,SpAFL6-LBD肽可以结合LPS、LTA、PGN等多糖,而且活性更强,表明该保守区域仍是活性中心,但是该阴离子短肽并没有表现出抑菌作用,暗示着其发挥抑菌作用仍需要LBD附近的氨基酸参与。我们研究还鉴定了SpALF7,通过生物信息学分析发现,与经典的ALF蛋白家族具有3个α-螺旋和4个β-折叠,并且依靠2个半胱氨酸形成1个二硫键维持核心功能域的三维结构不同,蛋白序列及结构预测显示,SpALF7只含有2个α-螺旋和4个β-折叠,并且该序列含有4个半胱氨酸,可能形成2个二硫键。对其组织分布和抗菌功能进行研究,发现SpALF7主要表达在血细胞;重组蛋白SpALF7体外抑菌功能研究发现SpALF7对除嗜水气单孢菌以外革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及真菌生长都有不同程度的抑制作用。SpALF7的细菌结合实验结果表明,SpALF7与副溶血弧菌、酵母菌和气单胞菌结合活性较强,而与金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠球菌结合活性较弱。微生物多糖结合实验显示,SpALF7可结合LPS,对金黄色葡萄球菌PGN、LTA和真核生物细胞壁组分β-葡聚糖也有一定的结合活性,暗示SpALF7的抗菌功能与其糖结合能力密切相关,可能利用与特定糖组分的结合,促进随后的抑菌功能。通过上述研究,本论文明确了SpALF6和SpALF7在青蟹免疫体系中发挥重要作用,阐明了两个抗菌肽的主要序列特征、抗菌特性及可能的抗菌机理,进一步揭示了ALF类分子抗菌活性与序列多态性之间的关系,具有重要的理论价值。此外,本研究还发现SpALF6和SpALF7对多重耐药的水产养殖弧菌具有明显的杀菌效果,显示了良好的应用前景。
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【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

【参考文献】