怀地黄连作障碍的微生物学机制及益生菌剂的研发

发布时间：2019-09-24 03:48

【摘要】：地黄,一种多年生草本植物,传统中医认为其块根具有极高的药用价值,但是,在它的生产过程中存在极其严重的连作问题:种植过地黄的同一土地8—10年内再次种植地黄将导致质量和产量急剧下降,这极大限制了地黄的生产。本研究采用高通量测序结合定量PCR技术探究了连作与非连作怀地黄病害发生时根际土壤微生物群落的改变;分离得到一些怀地黄致病菌,研究了一些植物益生菌对这些致病菌的抑制效果;本实验室在前期的研究工作中开发出在实验室条件下能促进怀地黄块根膨大的菌剂,在此基础上,我们将对致病菌有抑制作用的植物益生菌复合到已有菌剂中对其加以改良,开展两年大田试验,分别测试已有菌剂和改良后菌剂解决怀地黄连作障碍的效果。主要结果包括以下几个方面:(1)连作与非连作条件下健康和病害怀地黄根际土壤微生物的高通量测序结果表明,无论是头茬还是重茬,健康和病害怀地黄根际土壤微生物群落结构存在明显差异。Proteobacteria、Acidobacteria和Firmicutes是主要的细菌门,Ascomycota是主导的真菌门。从属的水平看,Sphingomonas和Streptomyces等有益细菌在头茬和重茬病害怀地黄根际土壤中的含量均低于其在健康怀地黄根际土壤中的含量;Pseudomonas在头茬和重茬病害怀地黄根际土壤中的含量均高于其在健康怀地黄根际土壤中的含量。真菌群落组成在各个样品中差别较大。头茬健康怀地黄根际土壤中真菌含量较高的属为Monographella和Thielaviopsis,两者占据了头茬健康怀地黄根际土壤真菌总量的近50%;而在头茬病害怀地黄根际土壤中Un--s-Hypocreales sp、Un--s-Nectriaceae sp、Myrothecium和Un--s-Ascomycota sp四个属含量较多;在重茬健康怀地黄根际土壤真菌组成中,Un--s-Nectriaceae sp、Un--s-Sordariales sp、Un--s-Ascomycota sp、Myrothecium、Phoma的含量最高;在重茬病害怀地黄根际土壤中Un--s-Sordariales sp、Un--s-Ascomycota sp和Un--s-Microascaceae sp处于优势地位,尤其是Un--s-Sordariales sp,其含量几乎达到了41%。综合两年的情况,Un--s-Ascomycota sp在病害怀地黄根际土壤中的含量高于其在健康怀地黄根际土壤中的含量;Monographella在病害怀地黄根际土壤中的含量低于其在健康怀地黄根际土壤中的含量。采用定量PCR技术分别对健康和病害怀地黄根际土壤中细菌、真菌的总量及变化明显的几个种属的微生物进行定量,探究病害发生时其丰度的具体变化。结果表明:病害怀地黄根际土壤中总细菌与总真菌的比值由7.63×109下降至8.70×106,Pseudomonas属细菌、F.oxysporum在病害怀地黄根际土壤中的丰度显著高于其在健康怀地黄根际土壤中的丰度;Sphingomona属细菌在头茬病害怀地黄根际土壤中丰度则低于其在健康怀地黄根际土壤中的丰度。(2)以病害怀地黄组织为材料,分离怀地黄致病菌,共获得三株霉菌,两株细菌和一株酵母菌。回接试验证明这些菌株均对怀地黄块根均具有一定的致病性,其中Rhizopus stolonifer、Rhodotorula paludigena、Pseudomonas hibiscicola与已知的两株致病菌Septoria digitalis Pass、Fusarium solani对怀地黄块根均具有100%的致病性。以实验室原有的混合植物益生菌对峙高致病性的致病菌,结果表明,混合菌对Pseudomonas hibiscicola没有作用,对Rhizopus stolonifer、Enterobacter aerogenes有较弱的抑制作用,对Septoria digitalis Pass、Fusarium solani、Rhodotorula paludigena均有明显的抑制作用。(3)第一年的大田试验结果表明:4种处理方式中处理3平均单株块根重最大,达到188.194 g/株,处理1与处理2分别为84.3495 g/株、82.3175 g/株,均极显著高于对照的56.3475 g/株,只有处理4低于对照,为55.4885 g/株,但没有达到显著性差异。所以,实验室已有的菌剂以合适的方式施加可以促进连作怀地黄块根膨大,但是不能解决怀地黄严重的病害问题。第二年大田试验结果表明:新菌剂可以显著提高怀地黄品种京九的平均单株块根重。
【图文】：

真菌,细菌,群落,样品

图 2-1 样品群落稀释曲线（A：细菌；B：真菌）所有样品的稀释曲线在 0-5000 条序列时快速上升，，5000 条序列之后增速逐渐接近饱和点，曲线趋于平坦，说明测序数据量渐进合理，更多的序列只会产生少量新的物种（图 2-1），而本次测序深度均达到 30000 条，所以测序深度已基本可以覆盖样品中的所有微生物，达到后续分析要求。（2）OTU 聚类及物种注释概况为了方便快速全面的了解各样品的 OTU 聚类情况和注释情况，对各样品的 OTU 聚类和注释结果进行了综合统计。就细菌而言，13 个样品共得到 711347 个有种属标记的Tags，平均每个样品约有 54719 个 Tags（图 2-2 A），有效数据以 97%的一致性（Identity）进行 OTUs 聚类，13 个样品共获得 50356 个 OTUs。在 G1h2、G1h3、G1d1、G1d2、G1d3、G1d4、G2h1、G2h2、G2h4、G2d1、G2d2、G2d3 和 G2d4 中分别有 4862、4293、4710、4501、2666、3954、3286、3783、3881、3215、3420、3653 和 4132 个 OTUs。真菌方A B

序列,聚类,真菌,细菌

17B图 2-2 各样品的 OTUs 聚类和注释情况统计 A：细菌；B：真菌。横坐标是样品名；第一纵坐标（TagsNumber）是 Tags 数目；Total Tags（红色）：指每个样品的总的 Tags 数目（等同于 Effective Tags，每个样品用于 OTU 聚类等后续分析的有效数据）；Unique Tags（橙色）：指频数为 1，并且无法被聚类到 OTUs 的 Tags 数目（无法聚类到 OTUs 的序列将不用于后续分析）；Taxon Tags（蓝色）：指用于构建 OTUs 并且获得注释信息的 Tags 数目；Unclassified Tags（茶绿色）指没有获得注释信息的 Tags数目；第二纵坐标（OTUs Number）是 OTUs 的数目，OTUs（紫色）：指每个样品得到的 OTUs 数目。G1h1 样品可能因取样问题，得到的 OTU 绝大部分是植物的，所以不用于后续分析。（3）连作与非连作条件下健康和病害怀地黄根际土壤门水平的微生物群落组成研究
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S435.672

【参考文献】