【摘要】：传染性胰腺坏死病(Infectious Pancreatic Necrosis,IPN)是由传染性胰腺坏死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus,IPNV)引起的一种主要危害鲑鳟鱼苗的高致死性疾病。自上世纪八十年代传入中国至今仍没有有效的防控药物,而由于毒株存在变异及安全因素,国外商品化疫苗无法直接引进及应用。本课题组于2013年IPN暴发期间在中国云南省某虹鳟养殖场分离到一株IPNV强毒(命名为ChRtm213)。本文对该毒株的全基因组序列进行了测定与分析,并在此基础上利用反向遗传操作技术构建了重组IPNV病毒(rChRtm213)。本研究对全面了解IPNV的结构与功能、揭示IPNV致病与免疫的分子机制等相关的研究具有重要意义。本研究利用逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)方法,从IPNV-ChRtm213细胞培养物的总RNA中获得了ChRtm213基因组片段并进行了序列测定,与GenBank中IPNV序列进行了比对,并运用软件对其进行生物信息学分析。序列分析结果表明,ChRtm213毒株的全基因组序列包含一个A链(3099 bp)编码多聚蛋白VP2-VP4-VP3,和一个B链(2789 bp)编码一个RNA依赖的RNA聚合酶VP1蛋白。系统发育分析表明,ChRtm213属于基因1型,血清型为A9(Jasper),和日本IPNV毒株AM98具有最高的同源性,其中A链与B链相似性分别为96.3%和97.3%。本研究通过In-Fusion无缝连接的方法成功构建了以T7 RNA聚合酶介导的IPNV高效反向遗传操作系统。分别在ChRtm213株A、B链上引入分子沉默性标签并将其克隆在真核表达载体(NDV vector)的T7启动子下游,构建了ChRtm213-NDV-A和ChRtm213-NDV-B重组质粒,然后通过LipofectamineTM2000(Invitrogen)介导,与表达T7RNA聚合酶的真核表达载体共转染CHSE-214细胞,转染后96 h利用新的单层CHSE-214继续扩增。通过噬斑纯化鉴定、电镜观察、间接免疫荧光检测、酶切分子标签检测证明了重组IPNV的存在。本研究成功构建了IPNV高效反向遗传操作系统。该系统具有稳定、简便等特点,能在CHSE-214上高效获得重组病毒。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S943
【参考文献】
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