两个hpal_x基因转化短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevs）HAB-5菌株及其转化子功能的初步研究

发布时间：2017-03-30 06:10

  本文关键词：两个hpal_x基因转化短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevs）HAB-5菌株及其转化子功能的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：HAB-5菌株是本实验室从棉花土壤根际中分离得到的一株短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis),具有广谱的抑菌效果。hpalxoo和hpaXm基因分别来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)和棉花角斑病菌(X. citri subsp. Malvacearum nov.comb. nov. nom. nov.),编码抗病激活蛋白harpinX,本研究利用化学方法将hpalxoo和hpaXm基因分别转化至野生型HAB-5菌株中,以期能实现harpin蛋白在短短芽孢杆菌内的高效表达,构建更高效稳定的生防菌株,为新型生物农药的开发和利用奠定基础。具体研究结果如下： 1.将hpalxoo及hpaXm基因转化HAB-5菌株,48h后在Amp抗性平板上得到了阳性转化子,其中,共获得转入hpalxoo的转化子有581个,转入hpaXm的转化子有650个。经PCR和PCR Southern Blot研究证实,目的基因hpaXm和hpalxoo已插入转化子中。 2.在LB培养基平板上培养72h后,发现转化子菌株菌落形态均发生了一定程度上的改变。经对峙培养后,各转化子菌株对芒果炭疽病菌C7-2菌株均有不同程度的抑制作用,但相对于HAB-5菌株,目前所筛选到的转化子菌株拮抗活性都减弱。 3.分别从hpalXoo和hpaXm转化子中选取代表性转化子B3xm和B5xoo,经SDS-PAGE电泳,供测试的转化子,在分子量大小约为39kD和41kD处均出现明显的条带,说明融合蛋白GST-HarpinXm和GST-HarpinXoo在转化子菌株中得到表达。 4.将GST-HarpinXoo粗蛋白、GST-HarpinXm粗蛋白,转化子B3xm粗蛋白及B5xoo粗蛋白注射烟草叶片,18h后均能在烟草叶片上激发过敏性反应(HR),而野生型HAB-5菌株粗蛋白不能激发HR；且转化子表达的harpin蛋白对酸碱不敏感,对热稳定,对紫外线和蛋白酶K敏感,与现已报道HarpinXoo、HarpinXm特性相同。 5.采用室内发芽试验法测定野生型菌株HAB-5、转化子B3xm及B5xoo三个菌株的菌悬液和发酵液对番茄种子生长的作用,结果表明,除HAB-5菌株1×109cfu/ml浓度外,各菌株各不同浓度的菌悬液对番茄种子的生长均有促进作用,其中,野生型HAB-5菌株菌悬液对胚芽和胚根的生长最适促生效果为34.6%和36.0%,相比于HAB-5菌株,转化子菌株B3xm、B5xoo菌悬液对胚芽和胚根的生长促进均有了明显的提高,尤其是B3xm菌株菌悬液,对胚芽和胚根生长的最适促生效果为100.8%和69.1%。经各菌株高浓度发酵液处理后的番茄种子不能发芽,对发芽势和发芽率的抑制作用为100%；将各菌株发酵液稀释10倍后,对种子发芽过程的抑制作用已基本解除,但对胚芽和胚根的生长仍有抑制作用；而当各菌株发酵液稀释到50倍后,对种子发芽的抑制作用已完全解除,还能明显促进胚芽和胚根的生长,且俩转化子菌株发酵液较野生型HAB-5菌株发酵液对胚芽和胚根的促进作用均有所提高,尤其是B3xm菌株发酵液,对胚芽和胚根的最适促生效果为54.5%和38.1%。 6.采用针刺法研究野生型菌株HAB-5、转化子B3xm及B5xoo三个菌株的菌悬液和发酵液对离体叶片上芒果炭疽菌株C7-2侵染的防治效果,结果显示,各菌株各个不同浓度的菌悬液对病原菌C7-2都有不同程度的抑制作用,且转化子B3xm及B5xoo菌株菌悬液较野生型HAB-5菌株的菌悬液在芒果叶片上对C7-2的抑制作用均有所增强；通过各菌株发酵液、发酵液稀释10倍及发酵液稀释50倍处理后,发现各组均对C7-2病原菌具有显著的抑制效果,且经各菌株发酵液稀释10倍处理后,对C7-2菌株的拮抗效果最好；此外,经转化子B3xm菌株发酵液和发酵液稀释10倍处理组后的实验组,比同组野生型HAB-5菌株对C7-2菌株的抑制作用均有所提高。 7.由于高浓度HAB-5菌悬液或发酵液具有抑制植物(番茄)种子发芽的趋势,这可能与生长素类物质分泌有关,因此,利用生长素极性运输抑制剂(TIBA)对生长素(IAA)极性运输的抑制作用原理,在菌株培养过程中加入不同浓度的TIBA,结果发现,加入不同浓度TIBA后的高浓度菌悬液对种子生长的抑制作用均被成功解除,还能对胚芽和胚根的生长有不同程度的促进作用,其中,含0.5mg/L TIBA的菌悬液为最适浓度,能最大程度上促进番茄种子的生长；而同样加入了不同浓度TIBA与菌株共培养的菌株发酵液,却对番茄种子的生长仍有抑制作用；此外,实验过程中还发现,经LB培养基处理组的番茄种子不能发芽,对番茄种子的生长有显著的抑制作用。
【关键词】：hpa_(Xm) ha1_(Xoo) 转化 短短芽孢杆菌HAB-5
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 目录8-12
• 一、引言12-23
• 1. hrp基因及其编码的harpin蛋白12-16
• 1.1 hrp基因和harpin蛋白12-13
• 1.2 Harpin蛋白在植物上的功能13-14
• 1.2.1 诱导植物抗病13-14
• 1.2.2 促进植物生长发育和诱导植物抗虫14
• 1.2.3 诱导植株耐旱14
• 1.3 Harpin激发防卫反应14-16
• 1.3.1 过敏性反应(HR)15
• 1.3.2 氧爆发15
• 1.3.3 其他防卫反应15-16
• 1.4 Harpin蛋白的表达系统16
• 2. 短短芽孢杆菌及其遗传改良16-21
• 2.1 短短芽孢杆菌的生物特性16-17
• 2.2 短短芽孢杆菌的抑菌作用及其机制17-18
• 2.2.1 对病原菌的抑制作用17
• 2.2.2 短短芽孢杆菌的抑菌作用机制17-18
• 2.3 短短芽孢杆菌的抗菌物质18-19
• 2.3.1 短杆菌肽18
• 2.3.2 短杆菌酪肽18-19
• 2.3.3 其它抗菌物质19
• 2.4 短短芽孢杆菌在国内外的研究及其应用19-20
• 2.4.1 对植物的促生作用19
• 2.4.2 保鲜作用19
• 2.4.3 微生物降解19-20
• 2.4.4 其他方面20
• 2.4.5 短短芽孢杆菌的防病作用20
• 2.5 短短芽孢杆菌的遗传改良20-21
• 2.5.1 短短芽孢杆菌表达系统20-21
• 2.5.2 芽孢杆菌的转化方法21
• 3. 生长素的极性运输抑制剂(TIBA)21-22
• 4. 本研究意义22-23
• 二、材料与方法23-34
• 1. 材料23-24
• 1.1 供试菌株23
• 1.2 供试菌株材料23
• 1.3 培养基23-24
• 1.4 主要试剂24
• 2. 方法24-34
• 2.1 质粒提取24-25
• 2.2 hpa1_(Xoo)及hpa_(Xm)基因转入HAB-5菌株25
• 2.3 引物设计与合成25-26
• 2.4 目的基因的PCR验证26
• 2.5 切胶回收26-27
• 2.6 克隆转化及测序27
• 2.7 HAB-5及其转化子菌株菌落形态和对C7-2菌株的平板拮抗作用测定27-28
• 2.7.1 菌株菌落形态观察27
• 2.7.2 对芒果炭疽菌C7-2菌株的平板拮抗作用27-28
• 2.8 粗蛋白的提取方法28
• 2.9 SDS-PAGE电泳28-29
• 2.10 烟草过敏性反应(HR)29
• 2.11 转化子粗蛋白特性的研究29-30
• 2.11.1 转化子粗蛋白热稳定性测定29
• 2.11.2 转化子粗蛋白耐酸碱性测定29
• 2.11.3 转化子粗蛋白对胰蛋白酶和蛋白酶K稳定性的测定29
• 2.11.4 转化子粗蛋白紫外线敏感性测定29-30
• 2.12 菌悬液和发酵液的配置30
• 2.13 短短芽孢杆菌HAB-5及其转化子菌株对番茄种子的促生作用测定30
• 2.13.1 对番茄种子的促生作用30
• 2.13.2 TIBA对抑制番茄种子生长的逆转作用30
• 2.14 对芒果炭疽离体叶片的拮抗效果30-31
• 2.15 PCR Southern Blot31-34
• 2.15.1 目的基因的PCR31
• 2.15.2 探针制备方法31
• 2.15.3 试剂配制31
• 2.15.4 洗胶和转膜31-32
• 2.15.5 预杂交和杂交32
• 2.15.6 洗膜和显色32-34
• 三、结果与分析34-57
• 1. 转化子菌株的筛选及PCR验证34-36
• 2. PCR Southern Blot验证36-37
• 2.1 目的基因的PCR扩增36
• 2.2 探针的制备和标记36-37
• 2.3 PCR Southern Blot37
• 3. 菌落形态对比37-38
• 4. 转化子对炭疽病菌株C7-2拮抗作用38-40
• 5. 转化子harpin蛋白的表达40
• 6. 转化子粗蛋白能激发烟草产生过敏性反应并具有harpin蛋白的特性40-41
• 7. HAB-5及其代表性转化子菌株菌悬液对番茄种子的促生效果41-45
• 8. HAB-5及其代表性转化子菌株菌悬液对芒果炭疽离体叶片的拮抗作用45-48
• 9. HAB-5及其代表性转化子菌株发酵液对番茄种子的促生作用48-51
• 10. HAB-5及其代表性转化子菌株发酵液对芒果炭疽离体叶片的拮抗效果51-53
• 11. TIBA对抑制番茄种子生长的逆转作用53-57
• 11.1 TIBA对HAB-5菌悬液抑制番茄种子生长的逆转作用53-54
• 11.2 TIBA对HAB-5发酵液抑制番茄种子生长的逆转作用54-57
• 四、讨论57-59
• 五、结论59-60
• 六、创新点60-61
• 七、参考文献61-67
• 已发表论文67
• 课题来源67-68
• 致谢68

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