蓝舌病病毒1型衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及竞争ELISA检测方法的建立

发布时间：2017-03-29 14:01

  本文关键词：蓝舌病病毒1型衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及竞争ELISA检测方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：为了探究蓝舌病(Bluetongue, BT)亚单位疫苗以及血清学检测方法,本研究从以下几个方面进行了探索：1. 培养BHK-21细胞大量繁殖1型蓝舌病病毒(BTV1)病毒液,利用蔗糖密度梯度离心从培养的病毒液中分离纯化BTV1,将纯化的BTV1灭活与弗氏完全佐剂混合乳化,免疫兔子和绵羊制备BTV多克隆抗体。2. Trizol法从BTV1病毒液提取总RNA,设计引物RT-PCR克隆BTV1的四个衣壳蛋白VP2、VP3、VP5、VP7基因,将克隆的目的基因插入pMD18-T载体,构建克隆载体TVP2、TVP3、 TVP5、TVP7。3.对克隆载体TVP2、TVP3、TVP5、TVP7和pFastBac HTB载体经双酶切,得到VP2、VP3、VP5、VP7基因和线性化的pFastBac HTB载体；再将四个衣壳蛋白基因插入线性化的pFastBac HTB载体,获得重组转座载体pVP2、pVP3、pVP5、pVP7;重组转座载体转化E.coli DH10 Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选获得重组杆粒rVP2、rVP3、rVP5、rVP7;利用脂质体转染法将重组杆粒转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,用其感染Sf9细胞,分别通过SDS-PAGE和Western-blot检测蛋白的表达情况及其生物活性,进行重组蛋白的表达和纯化。4. 利用表达的VP7重组蛋白,及前期制备的兔抗BTV多克隆抗体和绵羊抗BTV多克隆抗体,初步建立了蓝舌病抗体竞争ELISA检测方法。研究结果显示：1. 纯化得到了BTV1,免疫动物后获得的多克隆抗体效价均在1：1024以上2. 克隆的BTV1的四个衣壳蛋白VP2、VP3、VP5、VP7基因,大小依次为2886bp、2706bp、1581 bp、1050bp,与预期的结果相一致。3. 重组的杆状病毒感染Sf9细胞后,经SDS-PAGE和Western-blot分析,表达的四个蛋白的大小依次为115 ku、107 ku、61ku、38 ku,能够与BTV1阳性血清发生特异性反应。4. 用建立的抗体竞争ELISA方法对86份样品进行检测,其检测结果与国家虫媒病检测重点实验室提供的检测试剂盒相比,结果完全符合。但是,由于检测的样品数量有限,还需要检测大量的田间样品来对检测方法的特异性和敏感性进行进一步的研究。
【关键词】：蓝舌病病毒 衣壳蛋白 表达 竞争ELISA
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文缩略表10-11
• 第一章 引言11-19
• 1.1 蓝舌病概述11
• 1.2 蓝舌病病毒病原学研究11-12
• 1.3 蓝舌病疫苗的研究进展12-17
• 1.3.1 传统蓝舌病疫苗12-14
• 1.3.2 新型蓝舌病疫苗14-17
• 1.4 总结与展望17-19
• 第二章 BTV1多克隆抗体的制备与衣壳蛋白基因的克隆19-31
• 2.1 实验材料19-21
• 2.1.1 毒株、动物19
• 2.1.2 菌种、载体、细胞19
• 2.1.3 主要试剂19-20
• 2.1.4 主要仪器20
• 2.1.5 主要溶液和培养基的配置20-21
• 2.2 试验方法21-25
• 2.2.1 BTV1的细胞培养21
• 2.2.2 BTV1病毒粒子的纯化与鉴定21-22
• 2.2.3 BTV1多克隆抗体的制备22
• 2.2.4 BTV1 VP2、VP3、VP5、VP7基因引物的设计与合成22
• 2.2.5 BTV1 RNA的提取22-23
• 2.2.6 RT-PCR克隆目的基因23
• 2.2.7 目的基因的纯化回收23-24
• 2.2.8 目的基因与pMD18-T载体的连接24
• 2.2.9 连接产物的转化24
• 2.2.10 重组质粒的菌液PCR鉴定24-25
• 2.2.11 阳性质粒的提取25
• 2.2.12 阳性质粒的测序25
• 2.3 试验结果25-29
• 2.3.1 纯化BTV病毒粒子的SDS-PAGE鉴定25-26
• 2.3.2 衣壳蛋白基因的RT-PCR扩增26-28
• 2.3.3 BTV衣壳蛋白基因的克隆载体的鉴定28-29
• 2.4 讨论29-31
• 第三章 BTV1衣壳蛋白的真核表达与活性鉴定31-48
• 3.1 试验材料31-33
• 3.1.1 菌种、质粒、细胞31
• 3.1.2 主要试剂31-32
• 3.1.3 主要仪器32
• 3.1.4 主要溶液和培养基的配置32-33
• 3.2 试验方法33-39
• 3.2.1 感受态的制备33
• 3.2.2 重组转座质粒pVP2、pVP3、pVP5与pVP7的构建及鉴定33-35
• 3.2.3 重组杆粒rVP2、rVP3、rVP5与rVP7的构建与鉴定35-36
• 3.2.4 重组杆粒的精提取36-37
• 3.2.5 Sf9细胞的复苏与培养37
• 3.2.6 Sf9细胞的驯化37
• 3.2.7 Sf9细胞的悬浮培养37-38
• 3.2.8 重组杆粒转染Sf9细胞38
• 3.2.9 重组杆状病毒的收获与培养38
• 3.2.10 重组蛋白的SDS-PAGE与Western blotting分析38-39
• 3.2.11 重组蛋白VP7的表达与纯化39
• 3.3 试验结果39-46
• 3.3.1 重组转座质粒菌液PCR鉴定39-41
• 3.3.2 重组转座质粒的双酶切鉴定41-42
• 3.3.3 重组杆粒的PCR鉴定42-44
• 3.3.4 重组杆粒浓度测定44
• 3.3.5 重组杆状转染Sf9细胞结果44
• 3.3.6 重组蛋白的SDS-PAGE分析44-45
• 3.3.7 重组蛋白的Western-blot分析45-46
• 3.3.8 纯化重组VP7蛋白的SDS-PAGE分析46
• 3.4 讨论46-48
• 第四章 竞争ELISA检测方法的建立48-52
• 4.1 试验材料48
• 4.1.1 血清48
• 4.1.2 主要试剂48
• 4.1.3 主要仪器48
• 4.2 试验方法48-50
• 4.2.1 样品血清的抗体检测48-49
• 4.2.2 试剂最佳工作浓度的滴定49
• 4.2.3 竞争ELISA的试验步骤49-50
• 4.2.4 竞争ELISA的结果判定50
• 4.3 试验结果50-51
• 4.3.1 各试剂最佳工作浓度测试结果50
• 4.3.2 检测结果分析50-51
• 4.4 讨论51-52
• 第五章 全文结论52-53
• 参考文献53-58
• 附录58-59
• 致谢59-60
• 作者简历60

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