两种多糖对齐口裂腹鱼肠道消化酶、形态及菌群的影响

发布时间：2017-03-30 21:21

  本文关键词：两种多糖对齐口裂腹鱼肠道消化酶、形态及菌群的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本文研究了不同鱼龄齐口裂腹鱼(体重在100～300g之间(大鱼：300±0.15g,中鱼：200±0.15g,小鱼：100±0.15g)肠道形态及菌群,包括：肠道中嗜水气单胞菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌的分离鉴定及其产酶能力的研究,不同鱼龄鱼齐口裂腹鱼后肠肠道菌群的PCR-DGGE结果分析以及不同鱼龄齐口裂腹鱼肠道组织形态的分析。同时,研究了日粮中添加氧化魔芋葡甘聚糖(Oxidized Konjac Glucomannan, OKGM)和抗性淀粉(Resistant Starch, RS):0(对照组)、3.2%(氧化魔芋葡甘聚糖高剂量组H-OKGM)、1.6%(氧化魔芋葡甘聚糖中剂量组M-OKGM)、0.8%(氧化魔芋葡甘聚糖低剂量组L-OKGM)、6.4%(柠檬酸抗性淀粉高剂量组H-RS)、3.2%(柠檬酸抗性淀粉低剂量组L-RS)对齐口裂腹鱼肠道消化酶、肠道形态、后肠肠道菌群的PCR-DGGE结果以及对嗜水气单胞菌、芽孢杆菌和乳酸杆菌的数量的影响,以期为OKGM和RS这两种多糖作为功能性添加剂的进一步开发利用提供理论依据。主要结果如下：1、齐口裂腹鱼肠道形态及菌群分析结果：从健康齐口裂腹鱼肠道中分离的3株气单胞菌菌株,均为致病性嗜水性气单胞菌；分离到的三株芽孢杆菌中YB-08为解淀粉芽孢杆菌,YB-03和YB-20为枯草芽孢杆菌,三株菌株均能产蛋白酶和淀粉酶,且产酶能力稳定,产酶活性高；分离到的6株乳酸菌中RS-01和RS-04为短乳杆菌(Lactobacillus brevis),分离株RS-02和RS-06为棒状乳酸杆菌(Lactobacillus coryniformis),分离株RS-03和RS-09为弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus);大、中、小鱼肠道菌群的PCR-DGGE结果表明,大、中、小鱼相似性系数均处在中等相似范围内,但是中鱼组和小鱼组的相似度更高,且鱼龄对齐口裂腹鱼肠道菌群的丰富度有一定影响,大鱼组肠道内容物微生物菌群多样性最丰富；肠道组织切片结果表明,肠道肠绒毛高度、内环肌层厚度、外纵肌层厚度均随鱼龄增长而提高,但是小鱼前、中肠粘膜上皮高度均高于大、中鱼(p0.05)。2、两种多糖对肠道基础指标和消化酶的影响：饲料中不同OKGM和RS的添加量对齐口裂腹鱼的肠长指数和肠体指数无显著影响(p0.05)。饲料中添加OKGM和RS对齐口裂腹鱼后肠肠道蛋白酶活力具有显著影响,且添加量不同影响效果也不同；对中、后肠淀粉酶活力具有显著影响,且OKGM的影响效果要大于相同添加量的RS；对前肠脂肪酶活力无明显影响,但是能明显提高中肠脂肪酶活力显著降低后肠脂肪酶活力。不同剂量的OKGM在中肠与后肠中的作用效果不同,中肠中随着剂量增加而增加,后肠中剂量的效果最好。3、两种多糖对肠形态结构的影响：对肠道形态结构的影响：1)前肠：饲料中添加OKGM均可显著提高前肠肠绒毛高度、粘膜上皮高度(p0.05)和降低内环肌层厚度、外纵肌层厚度,且L-OKGM组作用效果最明显；饲料中添加RS均降低了前肠肠绒毛高度、粘膜上皮高度、内环肌层厚度、外纵肌层厚度,且L-RS组作用效果大于H-RS组。2)中肠：饲料中添加OKGM可提高中肠肠绒毛高度降低中肠内环肌层厚度、外纵肌层厚度,H-OKGM组和M-OKGM组均降低中肠粘膜上皮高度,但L-OKGM可提高中肠粘膜上皮高度；饲料中添加RS降低了中肠肠绒毛高度、粘膜上皮高度、内环肌层厚度、外纵肌层厚度,且H-RS组的肠绒毛有轻微损伤。3)后肠；饲料中添加OKGM能提高后肠肠绒毛高度、内环肌层厚度、外纵肌层厚度,但对粘膜上皮高度有所降低,不同剂量之间无显著差异；RS能降低后肠绒毛高度、粘膜上皮高度、外纵肌层厚度,但对内环肌层厚度有所提高,且两个剂量组除了肠绒毛高度外其它指标均有明显差异。4、两种多糖对后肠肠道菌群的影响：RS和RS添加量对齐口裂腹鱼肠道菌群的相似性系数无明显影响,低剂量的OKGM组与对照组的相似性系数最低(67.2),OKGM中、高剂量之间无显著差异；低剂量的RS组与对照组的相似性系数为76.2,高剂量的OKGM组与对照组的相似性系数为68.6。饲料中添加OKGM可提高齐口裂腹鱼后肠肠道菌群的多样性,且1.6%的OKGM组较对照组提高了10.20%。饲料中相同添加量的RS会降低肠道菌群多样性指数,但是未达到显著水平(p0.05)。5、两种多糖对肠道嗜水气单胞菌属和芽孢杆菌属的数量的影响：RS和OKGM均能有效抑制齐口裂腹鱼体内中、后肠嗜水气单菌的生长,其中后肠效果最明显。并且随着多糖添加量的增加,体内抑菌效果也有所增强。RS和OKGM均能有效促进齐口裂腹鱼体内前、中、后肠芽孢杆菌、乳酸杆菌的生长,且后肠效果最明显。并且添加量的不同,效果也有所不同。
【关键词】：氧化魔芋葡甘聚糖 抗性淀粉 消化酶 肠道形态 肠道菌群
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 符号说明9-13
• 1 文献综述13-21
• 1.1 鱼类肠道菌群的概述13-14
• 1.1.1 鱼类肠道菌群的形成及分布13
• 1.1.2 鱼类肠道菌群的生理功能13-14
• 1.1.2.1 营养与辅助消化作用13-14
• 1.1.2.2 防御功能14
• 1.2 益生元及其对肠道健康影响的概述14-18
• 1.2.1 益生元概念及种类14-16
• 1.2.2益生元对肠道健康的影响16-18
• 1.3 益生元在水产养殖中的应用18
• 1.4 研究目的及意义18-20
• 1.5 技术路线20-21
• 2 材料与方法21-36
• 2.1 主要原料及试剂21
• 2.2 主要试剂的配制21-24
• 2.2.1 DGGE主要试剂的配制22-23
• 2.2.2 消化酶测定相关试剂的配制23-24
• 2.3 主要仪器及设备24
• 2.4 试验方法24-36
• 2.4.1 不同鱼龄齐口裂腹鱼肠道样品的采集24-25
• 2.4.2 气单胞菌的分离鉴定25-26
• 2.4.3 芽孢杆菌的分离鉴定26-28
• 2.4.4 乳酸杆菌的分离鉴定28
• 2.4.5 不同鱼龄齐口裂腹鱼肠道菌群的DGGE分析28-30
• 2.4.6 不同鱼龄齐口裂腹鱼组织切片的观察30-31
• 2.4.7 动物的饲养及管理31-32
• 2.4.8 养殖试验样品的采集32
• 2.4.9 养殖试验组肠道基础指标测定32-33
• 2.4.10 养殖试验组肠道消化酶的测定33-34
• 2.4.11 养殖试验组后肠肠道菌群变化的DGGE分析34-35
• 2.4.12 养殖试验组肠道组织切片的制作35
• 2.4.13 养殖试验组肠道菌群数量的变化35-36
• 2.4.14 数据处理36
• 3 结果与分析36-65
• 3.1 气单胞菌的分离鉴定36-39
• 3.1.1 气单胞菌分离及菌落形态36-37
• 3.1.2 齐口裂腹鱼肠道中气单胞菌的多重PCR检测37-38
• 3.1.3 气单胞菌16S rRNA、aer和AHH的克隆及序列分析38-39
• 3.1.4 气单胞菌16S rRNA的进化起源分析39
• 3.2 芽孢杆菌的分离鉴定及产酶能力分析39-43
• 3.2.1 菌落及菌体的形态特征39-40
• 3.2.2 细菌的16S rDNA测定及序列分析40-41
• 3.2.3 产酶规律研究结果41-43
• 3.3 乳酸杆菌的分离鉴定43-45
• 3.3.1 乳酸杆菌形态特征43
• 3.3.2 乳酸杆菌的16S rDNA测定及序列分析43-45
• 3.4 不同鱼龄齐口裂腹鱼后肠肠道菌群的PCR-DGGE结果分析45-47
• 3.4.1 齐口裂用腹鱼肠道微生物16S rDNA的V3区PCR扩增结果45-46
• 3.4.2 齐口裂腹鱼后肠肠道菌群的PCR-DGGE指纹图谱的建立、聚类分析及相似性系数分析46-47
• 3.5 不同鱼龄齐口裂腹鱼肠道组织切片观察及测量结果47-49
• 3.5.1 前肠肠道形态结构47-48
• 3.5.2 中肠肠道形态结构48-49
• 3.5.3 后肠肠道形态结构49
• 3.6 OKGM和RS对齐口裂腹鱼肠体指数和肠重指数的影响49-50
• 3.7 OKGM和RS对齐口裂腹鱼肠道消化酶活力的影响50-52
• 3.7.1 OKGM和RS对齐口裂腹鱼蛋白酶活力的影响50-51
• 3.7.2 OKGM和RS对齐口裂腹鱼淀粉酶活力的影响51
• 3.7.3 OKGM和RS对齐口裂腹鱼脂肪酶活力的影响51-52
• 3.8 OKGM和RS对齐口裂腹鱼肠道形态的影响52-57
• 3.8.1 对前肠肠道形态的影响52-54
• 3.8.2 对中肠肠道形态的影响54-55
• 3.8.3 对后肠肠道形态的影响55-57
• 3.9 齐口裂腹鱼后肠肠道菌群的PCR-DGGE结果分析57-60
• 3.9.1 齐口裂用腹鱼后肠道微生物16S rDNA的V3区PCR扩增结果57
• 3.9.2 齐口裂用腹鱼后肠肠道菌群的PCR-DGGE指纹图谱的建立、聚类分析及相似性系数分析57-59
• 3.9.3 齐口裂用腹鱼后肠肠道菌群的多样性分析59-60
• 3.10 OKGM和RS对齐口裂腹鱼肠道微生物的影响60-64
• 3.10.1 对肠道中嗜水气单胞菌的影响60-62
• 3.10.2 对肠道中芽孢杆菌的影响62-64
• 3.11 对肠道中乳酸杆菌的影响64-65
• 4 讨论65-71
• 4.1 齐口裂腹鱼肠道特定细菌的分离鉴定65-67
• 4.2 齐口裂腹鱼肠道菌群的PCR-DGGE及肠道组织结构分析67-68
• 4.3 两种多糖对齐口裂腹鱼肠道消化酶的影响68-69
• 4.4 两种多糖对齐口裂腹鱼肠道结构的影响69-70
• 4.5 两种多糖对齐口裂腹鱼肠道微生物的影响70-71
• 5 结论与展望71-72
• 5.1 结论71-72
• 5.2 展望72
• 参考文献72-79
• 致谢79

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