三种常见蜜蜂病毒环介导等温扩增方法的建立

发布时间：2017-04-01 09:14

  本文关键词：三种常见蜜蜂病毒环介导等温扩增方法的建立，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蜜蜂是重要的授粉昆虫,对整个自然生态系统有着不可取代的作用。蜜蜂黑蜂王台病毒(black queen cell virus, BQCV)、蜜蜂残翅病病毒(deformed wing virus, DWV)、蜜蜂囊状幼虫病毒(sacbrood virus, SBV)是常见并且对蜜蜂危害严重的蜜蜂病毒。常用的检测方法有分子生物学、症状、免疫学等。但这些方法在仪器、技术等方面有特别的要求,实用性不强。因此针对BQCV、DWV、SBV建立一种快速、敏感性高、特异性强、无需专用设备的实用性检测方法是有必要的。环介导等温扩增技(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)在等温条件下,仅需要一个水浴锅在1h内就可完成反应,通过荧光染料即可观察结果,具有快捷、简便的特点。本研究建立并优化了BQCV-LAMP、DWV-LAMP、SBV-LAMP,验证特异性并与常规PCR技术对比验证敏感性,并分析其与PCR检测临床样本的差异。主要研究结果：1)建立并优化了BQCV-LAMP、DWV-LAMP、SBV-LAMP,优化后的BQCV-LAMP体系外、内引物比为1：3,甜菜碱浓度为0.8mmol/L, Mg2+浓度为2.0 mmol/L,在63℃条件下反应45 min; SBV-LAMP体系外、内引物比为1：2,甜菜碱浓度为0.6 mmol/L,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,在63℃条件下反应45 min；DWV-LAMP体系外、内引物比为1：4,甜菜碱浓度为0.6 mmol/L, Mg2+;浓度为2.0 mmol/L,在63℃条件下反应60 min。2) BQCV-LAMP、DWV-LAMP、SBV-LAMP均只有对BQCV、DWV、SBV出现多梯形条带,特异性好。BQCV-LAMP的灵敏度可达86龟的RNA模板,常规PCR 8.6 pg的RNA模板,说明BQCV-LAMP的灵敏度比BQCV-PCR的要高100倍；SBV-LAMP的灵敏度可达93 fg的RNA模板,常规PCR 0.93 pg的RNA模板,说明SBV-LAMP的灵敏度比SBV-PCR的要高10倍；DWV-LAMP的灵敏度可达8.9 fg 的RNA模板,常规PCR 8.9 pg的RNA模板,说明DWV-LAMP的灵敏度比DWV-PCR的要高100倍.3)临床检测：用BQCV-LAMP方法检测中华蜜蜂和意大利蜜蜂样本各20份,其中阳性数量分别为5和15,阳性检测率分别为25%和75%；PCR方法检测同样中华蜜蜂和意大利蜜蜂样本,阳性数量分别为3和11,阳性检测率分别为15%和55%。SBV-LAMP方法检测20份中华蜜蜂样本,阳性数量分别为12,阳性检测率分别为60%；PCR检测同样20份中华蜜蜂样本,阳性数量分别为9,阳性检测率分别为45%。DWV-LAMP方法检测20份意大利蜜蜂样本,阳性数量分别为11,阳性检测率分别为55%；DWV-PCR方法检测同样20份意大利蜜蜂样本,阳性数量分别为7,阳性检测率分别为35%。BQCV-LAMP、DWV-LAMP、SBV-LAMP三种检测方法均比相应的常规PCR方法检测率高。
【关键词】：黑蜂王台病毒 囊状幼虫病毒 残翅病毒 环介导等温扩增 检测
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S895
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 引言11-23
• 1.1 蜜蜂三种病毒研究进展12-19
• 1.1.1 蜜蜂病害12-13
• 1.1.2 蜜蜂病毒的分类及其分子生物学13-15
• 1.1.3 蜜蜂三种病毒的危害和发病特征15-17
• 1.1.4 三种病毒的传播17-19
• 1.1.5 三种病毒病的诊断方法19
• 1.2 环介导等温扩增技术19-22
• 1.2.1 LAMP技术原理20-21
• 1.2.2 LAMP反应特点21
• 1.2.3 LAMP的应用21-22
• 1.3 本研究的目的和意义22-23
• 2 材料和方法23-34
• 2.1 材料23-26
• 2.1.1 供试材料23
• 2.1.2 主要试剂与配制23-25
• 2.1.3 主要仪器25-26
• 2.2 试验方法26-34
• 2.2.1 引物设计与合成26-27
• 2.2.2 蜜蜂RNA提取及cDNA的合成27-28
• 2.2.3 LAMP检测蜜蜂三种病毒方法的建立28-29
• 2.2.4 LAMP体系优化29-31
• 2.2.5 扩增区域的克隆测序31-34
• 2.2.6 敏感性和特异性试验验证34
• 2.2.7 临床样本的检测34
• 3 实验结果34-56
• 3.1 应用LAMP检测BQCV的研究结果34-42
• 3.1.1 BQCV-LAMP反应体系的优化34-35
• 3.1.2 BQCV-LAMP外引物的PCR反应与鉴定35-37
• 3.1.3 LAMP与PCR的敏感性对比试验37-38
• 3.1.4 可视化LAMP的特异性试验38-39
• 3.1.5 临床样本的检测39-42
• 3.2 应用LAMP检测SBV的研究结果42-49
• 3.2.1 SBV-LAMP反应体系的优化42-44
• 3.2.2 SBV-LAMP外引物的PCR反应与鉴定44-45
• 3.2.3 LAMP与PCR的敏感性对比试验45-46
• 3.2.4 可视化LAMP的特异性试验46-47
• 3.2.5 临床样本的检测47-49
• 3.3 应用LAMP检测DWV的研究结果49-56
• 3.3.1 DWV-LAMP反应体系的优化49-51
• 3.3.2 DWV-LAMP外引物的PCR反应与鉴定51-52
• 3.3.3 LAMP与PCR的敏感性对比试验52-53
• 3.3.4 可视化LAMP的特异性试验53-54
• 3.3.5 临床样本的检测54-56
• 4 讨论56-61
• 4.1 关于LAMP引物设计的讨论56-57
• 4.2 关于LAMP体系优化57-58
• 4.3 关于LAMP产物验证58
• 4.4 关于LAMP结果观察58-59
• 4.5 BQCV-LAMP、SBV-LAMP、DWV-LAMP体系的优势59-60
• 4.6 本研究的展望60-61
• 参考文献61-70
• 致谢70

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本文编号：280376