稻瘟病抗性相关基因OsOGCP、OsDXR和OsRPA3α的克隆与功能初步分析

发布时间：2017-04-03 02:07

  本文关键词：稻瘟病抗性相关基因OsOGCP、OsDXR和OsRPA3α的克隆与功能初步分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：水稻是世界上重要的粮食作物之一。发掘抗病基因,培育持久抗病的水稻新品种始终是一大研究热点。本论文在粳稻云引受稻瘟病菌诱导的转录组学数据分析基础上,筛选出可能与水稻稻瘟病抗性相关的3个基因,分别是(1)编码线粒体载体蛋白的AK068090(暂时命名为OsOGCP);(2)编码1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸盐还原异构酶的AF367205(暂时命名为OsDXR);(3)编码含OB-fold结构域的核酸结合蛋白的AK070400(暂时命名为OsRPA3a)。为了进一步确定这3个基因的功能,我们选用广谱抗稻瘟病品种云引和普感品种丽江新团黑谷(LTH)为材料,分别从云引和LTH中克隆了这3个基因并进行初步功能分析。主要研究结果如下：1.分别以云引和丽江新团黑谷叶片的cDNA为模板,扩增3个目的基因的CDS和启动子序列。序列比对结果发现基因OsOGCP、OsDXR和OsRPA3a的CDS序列以及基因OsRPA3a的启动子序列各自在云引和丽江新团黑谷两个品种中完全一致,而且与NCBI中登录的序列相同；基因OsOGCP和OsDXR的启动子序列在云引和丽江新团黑谷两个品种中同源性分别为95.98%和98.78%。2.利用RACE技术分别获得3个目的基因的cDNA全长序列,然后利用MEGA5.1分别构建相应基因的系统进化树,初步分析和预测这3个基因可能具有的功能,其中OsOGCP基因与禾本科黍属编码α-酮戊二酸载体蛋白的基因亲缘关系较近,且位于同一分支上；OsDXR基因与姜属编码1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶的基因有较近的亲缘关系；OsRPA3a基因与玉米属中编码逆转录转座子蛋白的基因亲缘关系较近。3.通过实时荧光定量PCR技术分析这3个目的基因在受稻瘟病菌诱导后不同时间段的表达情况。结果表明,随着接种稻瘟病菌时间的推移,3个基因的表达量也发生相应的变化,说明这3个基因的表达受稻瘟病菌诱导。4.分别构建了这3个目的基因的植物过表达载体、RNAi干扰表达载体和植物亚细胞定位载体,并通过农杆菌介导转入云引中,从而获得相应的转基因水稻植株,为后期的基因功能研究奠定了基础。
【关键词】：粳稻 云引 稻瘟病 基因克隆 载体构建 农杆菌转化
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.111.41
【目录】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 第一章 绪论11-19
• 1.1 研究背景11-12
• 1.2 稻瘟病研究进展12-14
• 1.2.1 稻瘟病抗性基因的遗传学研究12
• 1.2.2 稻瘟病抗性基因的定位和克隆研究12-14
• 1.3 相关候选基因研究进展14-16
• 1.3.1 α-酮戊二酸/苹果酸载体蛋白研究14
• 1.3.2 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶研究14-15
• 1.3.3 DNA复制蛋白A的研究15-16
• 1.4 实时荧光定量PCR16
• 1.5 RACE技术16-17
• 1.6 农杆菌介导的遗传转化17
• 1.7 研究目的及意义17-19
• 第二章 候选基因表达量分析19-27
• 2.1 实验材料19
• 2.1.1 植物材料和菌株19
• 2.1.2 主要试剂19
• 2.2 实验方法19-23
• 2.2.1 材料准备19-20
• 2.2.1.1 水稻幼苗的种植19
• 2.2.1.2 稻瘟病菌的活化、培养及孢子悬浮液的配制19-20
• 2.2.1.3 水稻幼苗接种和叶片采集20
• 2.2.2 目的基因mRNA序列的获得20
• 2.2.3 水稻叶片总RNA的提取20-21
• 2.2.4 cDNA的合成21-22
• 2.2.5 实时荧光定量PCR引物设计22
• 2.2.6 实时荧光定量PCR反应22-23
• 2.3 结果与分析23-26
• 2.3.1 水稻幼苗接种稻瘟病菌“四川-43”23-24
• 2.3.2 水稻总RNA的鉴定24
• 2.3.3 实时荧光定量PCR分析24-26
• 2.4 讨论26-27
• 第三章 候选基因的克隆及序列分析27-43
• 3.1 实验材料27
• 3.1.1 植物材料27
• 3.1.2 主要试剂27
• 3.2 实验方法27-36
• 3.2.1 候选基因编码区序列扩增27-30
• 3.2.1.1 提取叶片总RNA27
• 3.2.1.2 cDNA的获得27
• 3.2.1.3 引物设计27-28
• 3.2.1.4 目的片段扩增及回收28-29
• 3.2.1.5 目的片段与pEASY~(TM)-Blunt Cloning Vector连接29
• 3.2.1.6 连接产物转化Transl-T1感受态细胞29-30
• 3.2.1.7 测序及序列分析30
• 3.2.2 候选基因非编码区序列的扩增30-33
• 3.2.2.1 提取云引和丽江新团黑谷叶片总RNA30
• 3.2.2.2 cDNA的合成30-31
• 3.2.2.3 候选基因RACE引物设计31
• 3.2.2.4 目的基因5'UTR及3'UTR的扩增及回收31-32
• 3.2.2.5 目的片段与pEASYTM-Blunt Cloning Vector连接及转化32
• 3.2.2.6 测序及序列分析32-33
• 3.2.3 候选基因启动子序列的扩增33-35
• 3.2.3.1 叶片总DNA的提取33
• 3.2.3.2 启动子序列引物设计33-34
• 3.2.3.3 启动子序列扩增及回收34
• 3.2.3.4 目的片段与pEASY~(TM)-Blunt Cloning Vector连接34
• 3.2.3.5 测序及序列分析34-35
• 3.2.4 云引和丽江新团黑谷OsOGCP和OsDXR基因组序列的扩增35-36
• 3.2.4.1 基因组序列引物设计35
• 3.2.4.2 基因组序列扩增35
• 3.2.4.3 目的片段与pEASY~(TM)-Blunt Cloning Vector连接35
• 3.2.4.4 测序及序列分析35-36
• 3.3 结果与分析36-41
• 3.3.1 云引和丽江新团黑谷中目的基因编码区序列克隆和比对36-37
• 3.3.2 云引中候选基因5'和3'非编码区序列扩增37-38
• 3.3.3 云引和丽江新团黑谷中候选基因启动子克隆及序列比对38-40
• 3.3.4 候选基因OsOGCP和OsDXR基因组结构分析40-41
• 3.3.5 目的基因的进化树构建及分析41
• 3.4 讨论41-43
• 第四章 候选基因植物过量表达载体、亚细胞定位载体和干扰载体的构建及遗传转化43-60
• 4.1 实验材料43
• 4.1.1 菌株和质粒43
• 4.1.2 植物材料43
• 4.1.3 主要试剂43
• 4.2 实验方法43-52
• 4.2.1 候选基因过量表达载体和亚细胞定位载体的构建43-48
• 4.2.1.1 目的基因酶切位点分析43
• 4.2.1.2 带酶切位点的目的基因的扩增43-45
• 4.2.1.3 目的片段与pEASy~(TM)-Blunt Cloning Vector连接及转化45
• 4.2.1.4 目的片段测序及序列分析45
• 4.2.1.5 双酶切含目的基因的阳性质粒及pCAMBIA1302空载体45-47
• 4.2.1.6 目的片段与pCAMBIA1302载体的连接47
• 4.2.1.7 连接产物转化与鉴定47
• 4.2.1.8 过表达载体冻融法转化农杆菌47-48
• 4.2.2 候选基因RNAi干扰表达载体的构建48-52
• 4.2.2.1 带酶切位点的目的基因的扩增及回收48-50
• 4.2.2.2 目的片段与pEASY~(TM)-Blunt Cloning Vector连接及转化50
• 4.2.2.3 目的片段测序及序列分析50
• 4.2.2.4 RNAi干扰中间载体构建50-51
• 4.2.2.5 候选基因RNAi干扰表达载体第二联构建51-52
• 4.2.2.6 RNAi干扰表达载体冻融法转化农杆菌GV310152
• 4.3 农杆菌介导水稻遗传转化52-53
• 4.4 结果与分析53-59
• 4.4.1 植物过量表达载体和亚细胞定位载体的获得53-56
• 4.4.2 植物干扰表达载体的获得56-58
• 4.4.3 农杆菌介导的遗传转化58-59
• 4.5 讨论59-60
• 第五章 结论60-61
• 参考文献61-69
• 附录69-78
• 致谢78

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