辽宁绒山羊蛋白脂质蛋白质基因（PLP2）的表达研究

发布时间：2017-04-03 05:07

  本文关键词：辽宁绒山羊蛋白脂质蛋白质基因（PLP2）的表达研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：辽宁绒山羊是我国特有的禁止基因外流的宝贵遗传资源,产绒量居全国第一。在前期工作中,我们通过建库及Primer walking质粒测通的方法克隆筛选出蛋白脂质蛋白质基因(proteolipid protein 2,PLP2)的全长序列。为了探究该基因的功能,我们对其进行了生物信息学分析(包括预测其开放阅读框,亲疏水性分析、跨膜预测分析、信号肽预测分析、磷酸化位点预测分析、二级结构预测、进化树的构建、多重序列的比对、保守结构域搜索),Real-time PCR,RT-PCR,原位杂交以及Noggin基因干扰慢病毒感染后目的基因的qPCR检测等的一系列分析研究。分析结果显示:首先,通过生物信息学分析,我们发现PLP2基因能够编码含有152个氨基酸的蛋白质,二级结构预测显示,PLP2基因含有α螺旋结构(46.05%)、延伸结构(12.5%)和无规卷曲结构(41.45%),功能位点分析显示,PLP2含有MARVEL结构域并且存在4个跨膜区,不存在信号肽,PLP2氨基酸含有3个Ser、2个Tyr和1个Thr可能成为蛋白激酶磷酸化位点;其次,通过RT-PCR检测显示,PLP2基因在皮肤、心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏中均有表达,且表达差异不是很明显,其中皮肤中的表达含量相对较高;同时,还运用了荧光定量PCR技术,定量的检测其在不同时期的表达情况,发现在兴盛期时,PLP2基因在次级毛囊的表达量约为初级毛囊的1.02倍(0.01P0.05),在退行期时,PLP2基因的表达量仍是次级毛囊高于初级毛囊,是初级毛囊的1.16倍(0.01P0.05);另外,经过原位杂交分析,发现PLP2基因在内根鞘有表达,而在外根鞘、毛干(角质层、皮层和髓层)以及毛囊乳突中无表达;最后,通过Noggin基因干扰后PLP2基因的qPCR检测,显示空白组的表达量是NC阴性对照的1.15倍,而noggin干扰后PLP2的表达量是NC阴性对照组的0.64倍。结论:(1)PLP2基因在皮肤、心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏各个组织中都有表达,这说明PLP2与各脏器相关功能无直接联系;(2)PLP2基因在兴盛期和退行期中的表达量均是次级毛囊高于初级毛囊,这说明PLP2基因对绒毛细度有一定的调节作用;(3)PLP2基因仅在内根鞘中有所表达,推测PLP2基因可能和绒毛脱落有关。(4)noggin基因干扰后,PLP2的表达量下降,这说明PLP2基因连同noggin基因等其他通路中的抑制基因一起,可能会对BMP通路有一定的影响,进而影响毛囊的发育。
【关键词】：辽宁绒山羊 PLP2 生物信息学分析 荧光定量PCR Noggin基因干扰慢病毒
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 引言8
• 1 背景概述8-12
• 1.1 辽宁绒山羊8
• 1.2 BMP及BMP信号通路8-9
• 1.3 PLP基因和PLP2基因及其研究进展9-10
• 1.4 研究的目的及意义10-12
• 2 PLP2基因的序列分析12-24
• 2.1 PLP2全长序列测定12-13
• 2.1.1 primer walking测序方法12
• 2.1.2 结果12-13
• 2.2 PLP2生物信息学分析13-24
• 2.2.1 方法13-14
• 2.2.2 结果14-22
• 2.2.3 讨论22-24
• 3 PLP2基因在辽宁绒山羊毛囊不同生长时期的表达研究24-41
• 3.1 实验材料24
• 3.2 试剂及仪器24-25
• 3.2.1 实验试剂24
• 3.2.2 实验仪器24-25
• 3.3 方法25-32
• 3.3.1 初、次级毛囊的分离25
• 3.3.2 初、次级毛囊总RNA提取25-26
• 3.3.3 总RNA的检测26
• 3.3.4 反转录PCR反应26-27
• 3.3.5 半定量RT-PCR检测27-29
• 3.3.6 荧光定量PCR反应29-30
• 3.3.7 原位杂交30-32
• 3.4 实验结果32-39
• 3.4.1 RNA提取32-33
• 3.4.2 RT-PCR33-36
• 3.4.3 实时荧光定量PCR实验结果36-38
• 3.4.4 原位杂交实验结果38-39
• 3.5 讨论39-41
• 4 Noggin基因干扰后PLP2基因的表达检测41-50
• 4.1 实验材料及主要实验仪器41-42
• 4.1.1 实验材料41
• 4.1.2 主要实验仪器41-42
• 4.2 实验步骤42-44
• 4.2.1 细胞培养42
• 4.2.2 Noggin基因干扰病毒及阴性对照腺病毒感染目的细胞42
• 4.2.3 总RNA的抽提42
• 4.2.4 RNA反转录成cDNA42-43
• 4.2.5 qPCR引物设计43
• 4.2.6 qPCR实验43-44
• 4.3 实验结果44-49
• 4.3.1 病毒感染前后细胞图片44-45
• 4.3.2 预实验qPCR产物电泳图45-46
• 4.3.3 正式实验qPCR产物电泳图46-47
• 4.3.4 qPCR数据分析47-49
• 4.4 讨论49-50
• 结论50-51
• 参考文献51-56
• 附录A 原位杂交实验试剂配制方法56-57
• 附录B 不同时期 β-actin、PLP2基因的扩增曲线和溶解曲线图57-61
• 附录C Noggin基因干扰后PLP2基因及内参基因的PCR扩增曲线和溶解曲线61-62
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况62-63
• 致谢63

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