福氏志贺菌基因组分析及耐药机理研究

发布时间：2017-04-03 16:05

  本文关键词：福氏志贺菌基因组分析及耐药机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：志贺氏菌病又称细菌性痢疾,是一种具有高度传染性和严重危害性的肠道传染病,严重危害人类的健康和生命安全,在我国流行的优势菌株为福氏志贺菌2a型,其主要感染人群为5岁以下的儿童和免疫障碍的人群。世界卫生组织推荐治疗菌痢的首选药物为环丙沙星,其次为头抱曲松和匹美西林。本文采用临床常用的环丙沙星、头孢曲松和一种广谱抗生素四环素分别诱导福氏志贺菌301株产生耐药性,然后对菌株基因组测序,从而在基因组水平研究其耐药机理。1.根据Gene Bank中发表的各志贺菌血清型特性基因ipa H(M32063)、gtrⅡ(AF021347)、gtrⅩ(L05001)、R002(AF250878)组成多重PCR体系,用于福氏志贺菌301株的验证,能够在多种细菌中快速、灵敏、特异的检测出福氏志贺菌301株,不仅为之后实验过程中保证菌株不受污染奠定了基础,同时创造出了一种快速检测分离志贺菌的有效方法。2.利用一系列梯度浓度的环丙沙星、头孢曲松、四环素对福氏志贺菌标准株分别诱导后其MIC分别为64μg/m L、64μg/m L、128μg/m L,均已达到耐药水平。依据各抗生素诱导菌株MIC增长曲线我们选定福氏志贺菌301株标准菌进行de novo测序,环丙沙星、四环素诱导的5、7、10代和头孢曲松诱导的5、9、10代进行重测序。3.de novo测序共产生732 Mb数据,组装后经基因组组分分析得到4,832个基因,78个串联重复序列,44个小卫星序列,11个微卫星序列,102个t RNA和16个r RNA。然后采用GO、KEGG、Swiss-Prot、COG、NR、Tremble、CAZy、ARDB、VFDB、PHI、T3SS等多个数据库对得到的4832个基因序列进行基因名、基因功能注释和分类,针对各数据库特征,综合利用各数据库的优点完善实验研究。利用de novo测序数据与已公布的福氏志贺菌301株基因组(NC_004337)比对检测到317个SNP位点,包括74个同义突变;237个非同义突变和6个无义突变。4.重测序序列与de novo序列比对后发现多个突变位点,即met G基因位点284497在TC-2、CIP-2、CRO-3中由T-G的突变;gyr B基因位点1953446在CIP-2中由C-A的突变;gyd A基因位点670796在CIP-7中由A-C的突变;rob基因位点335049在CIP-10中由G-A的突变;nar X基因位点1072783在CRO-8中由A-G的突变。以及间区位点1538933在CIP3、CRO3、TC3中由A-T;1538929在CIP5、CR04、TC5中由G-A;1538924在CIP8、CRO8、TC5中由G-C。5.对共有的突变基因met G(甲硫氨酰t RNA合成酶)功能注释发现,met G主要影响甲硫氨酸的活化与转移,且影响其他氨基酸的活化,在KEGG途径注释发现met G最终影响蛋白质的合成。间区突变会影响酞酰脯氨酰顺反异构酶ppi A的功能。研究表明met G和ppi A基因突变不仅影响蛋白质的合成,而且还是一个潜在的抗生素靶标。
【关键词】：福氏志贺菌 耐药性 de novo 重测序 基因突变
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 附件3-5
• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 志贺菌病的危害及其分类13-14
• 1.2 细菌耐药机理研究进展14-16
• 1.2.1 产生灭活酶或钝化酶14
• 1.2.2 抗生素渗透障碍14-15
• 1.2.3 影响细菌外排作用15
• 1.2.4 抗生素作用靶位的改变15
• 1.2.5 总结15-16
• 1.3 高通量测序技术16-17
• 1.3.1 Illumina测序原理16
• 1.3.2 Illumina测序应用16
• 1.3.3 高通量测序在细菌耐药性研究中的应用16-17
• 1.3.4 高通量测序在细菌耐药性研究中的应用17
• 1.4 细菌非编码小RNA研究17-19
• 1.4.1 细菌sRNA分类17-18
• 1.4.2 细菌sRNA的相关功能18
• 1.4.3 sRNA分子伴侣Hfq蛋白18-19
• 1.4.4 sRNA研究方法19
• 1.5 本研究意义19-21
• 第二章 福氏志贺菌2型多重PCR分型及应用21-27
• 2.1 材料与方法21-23
• 2.1.1 菌株21
• 2.1.2 模板制备21
• 2.1.3 目的基因的克隆及条件优化21-23
• 2.2 结果与分析23-26
• 2.2.1 单重PCR对引物特异性验证结果23
• 2.2.2 多重PCR条件的优化23-24
• 2.2.3 模板用量优化24-25
• 2.2.4 灵敏度检测25-26
• 2.3 讨论26-27
• 第三章 福氏志贺菌 2a 301株耐药菌株的构建27-31
• 3.1 实验材料27-28
• 3.1.1 菌株27
• 3.1.2 主要设备与试剂27-28
• 3.2 试验方法28-29
• 3.2.1 抗生素贮存原液的配制28
• 3.2.2 福氏志贺菌301株标准株MIC测定28
• 3.2.3 药敏试验判定标准28
• 3.2.4 福氏志贺菌301株耐药菌株诱导28-29
• 3.3 结果与分析29-30
• 3.4 讨论30-31
• 第四章 福氏志贺菌301株基因组测序及耐药基因筛选31-48
• 4.1 样品及试剂、仪器31
• 4.2 试验方法31-33
• 4.2.1 DNA提取31
• 4.2.2 实验流程31-32
• 4.2.3 生物信息分析流程32-33
• 4.2.4 测序结果组装组装33
• 4.3 实验结果与分析33-46
• 4.3.1 de novo测序结果33-34
• 4.3.2 原始数据质控34
• 4.3.3 结果评价34-36
• 4.3.4 基因组份分析36-38
• 4.3.5 基因功能分析38-41
• 4.3.6 比较基因组分析41-44
• 4.3.7 de novo测序结果与参考序列对比结果44-46
• 4.4 讨论46-48
• 4.4.1 细菌基因组de nove46
• 4.4.2 基因数据库应用46-47
• 4.4.3 SNP突变与插入缺失47-48
• 第五章 福氏志贺菌耐药诱导菌株重测序及突变位点验证48-57
• 5.1 样品及试剂、仪器48
• 5.2 试验方法48-52
• 5.2.1 DNA提取与试验流程48
• 5.2.2 细菌重测序生物信息分析流程48-49
• 5.2.3 原始数据质控49
• 5.2.4 组装49
• 5.2.5 比较基因组分析49-50
• 5.2.6 突变位点验证50-52
• 5.3 结果与分析52-55
• 5.3.1 测序数据概况52
• 5.3.2 比较基因组分析52-54
• 5.3.3 测序结果验证54
• 5.3.4 多耐药基因代谢通路分析54-55
• 5.4 讨论55-57
• 第六章 全文结论57-58
• 参考文献58-65
• 致谢65-66
• 作者简介66

【参考文献】

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