细胞分裂素和生长素调控杨树分生组织活动的机理研究

发布时间：2017-04-04 16:10

  本文关键词：细胞分裂素和生长素调控杨树分生组织活动的机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：茎端分生组织(Shoot apical meristem, SAM)的离体发生是植物基因工程的先决条件,维管形成层的活动是植物次生生长和木材形成的基础。研究表明细胞分裂素在离体芽发生和形成层活动过程中均发挥了至关重要的作用,然而在木本植物中,其调控机制目前尚不清楚。本研究以84K杨为材料,建立了一套稳定的农杆菌介导的遗传转化体系。利用人工合成的生长素响应启动子DR5驱动GUS报告基因对离体芽发生过程中生长素响应信号的分布模式进行了分析。结果表明,离体芽诱导初期,生长素响应信号在愈伤组织的边缘均匀分布,并随着诱导时间的延长逐渐开始区域化分布；茎端分生组织开始形成时,DR5::GUS信号集中在茎端分生组织的上部两侧；茎端分生组织形成后,GUS信号特异分布在L1层细胞中。原位杂交结果显示,编码杨树细胞分裂素B类反应调节因子的RR12和RRl3基因的表达信号在离体芽诱导初期在愈伤组织的边缘均匀分布,随后呈现出区域化集中的分布模式,最终在除L1层细胞以外的整个茎端分生组织中均有分布。上述时空分布模式与拟南芥中的情况是一致的,表明生长素和细胞分裂素在调控杨树和拟南芥离体芽发生过程中所起的作用是相似的。利用artifical microRNA手段同时下调这两个基因的表达获得了一系列amiR-RR12,13转基因株系。选取转基因植株叶片进行离体芽诱导,结果发现与野生型相比,RR12和RR13的表达量下调后,导致离体芽发生频率和每块外植体上形成离体芽的数目均明显降低,表明RR12和RR13参与了杨树离体芽的发生过程。进一步的分析发现,RR12和RR13在维管形成层区域有较强的表达信号。下调RRl2和RR13的表达量造成杨树植株生长受到抑制。统计结果表明,amiR-RR12,13转基因植株茎第20节的直径明显小于野生型对照。细胞学分析发现,与野生型相比,amiR-RR12,13转基因植株茎的次生木质部和次生韧皮部比例降低、次生生长受到了抑制。qRT-PCR结果显示RR12和RR13在amiR-RR12,13转基因植株茎中的转录水平明显降低,而其他B类RRs未表现出明显变化,表明上述表型是特异降低RR12和RR13转录水平的结果。这些结果说明RR12和RR13通过维持维管形成层的正常活动参与了对次生生长过程的调控。本研究的结果表明,细胞分裂素通过其下游信号转导途径中的RR12和RR13介导了离体芽的发生和维管形成层的活动,并在上述过程中发挥了正向调控作用。
【关键词】：杨树 芽发生 生长素 细胞分裂素 细胞分裂素反应调节因子 形成层
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S792.11
【目录】：

• 符号说明4-8
• 中文摘要8-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-25
• 1.1 细胞分裂素11-16
• 1.1.1 细胞分裂素的生物合成11-13
• 1.1.2 细胞分裂素的运输13
• 1.1.3 细胞分裂素的代谢13
• 1.1.4 细胞分裂素的信号传导13-16
• 1.2 植物离体芽发生的分子机理16-19
• 1.2.1 植物离体芽发生分子机理的研究进展16-18
• 1.2.2 杨树离体芽发生相关研究18-19
• 1.3 植物维管形成层活动的机理19-24
• 1.3.1 植物维管形成层的结构20
• 1.3.2 植物形成层发生及发育20-21
• 1.3.3 植物形成层活动的分子调控机制21-23
• 1.3.4 细胞分裂素对形成层生长的调控机理23-24
• 1.4 本研究的目的意义24-25
• 2 材料与方法25-42
• 2.1 实验材料25-26
• 2.1.1 植物材料和生长条件25
• 2.1.2 菌株和质粒25
• 2.1.3 试剂和仪器25-26
• 2.2 实验方法26-42
• 2.2.1 植物总RNA的提取26-27
• 2.2.1.1 检测RNA的质量和浓度26-27
• 2.2.1.2 反转录cDNA第一链的合成27
• 2.2.2 植物基因组DNA的提取27
• 2.2.3 Artificial microRNA沉默RR12/13基因表达载体的构建27-30
• 2.2.4 质粒的提取30
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(热击法)30-31
• 2.2.6 大肠杆菌细胞的转化31-32
• 2.2.7 目的片段和质粒DNA的酶切与回收32
• 2.2.8 DNA测序32
• 2.2.9 GV3101农杆菌感受态的制备32
• 2.2.10 农杆菌感受态细胞的转化(电击法)32-33
• 2.2.11 农杆菌介导的杨树叶盘法遗传转化及抗性植株的获得33-34
• 2.2.12 转基因杨树的GUS染色鉴定和石蜡切片34-35
• 2.2.12.1 对转DR5：：GUS的杨树取材固定进行GUS染色34
• 2.2.12.2 材料脱水、透明、浸蜡和包埋34-35
• 2.2.12.3 切片35
• 2.2.12.4 TBO染色35
• 2.2.13 实时定量PCR分析35-36
• 2.2.14 原位杂交分析36-42
• 2.2.14.1 材料的固定36
• 2.2.14.2 材料的包埋36-37
• 2.2.14.3 切片37
• 2.2.14.4 探针标记37-40
• 2.2.14.5 脱蜡、消化、乙酰化和杂交40-41
• 2.2.14.6 洗片41
• 2.2.14.7 检测41-42
• 3 结果与分析42-54
• 3.1 杨树遗传转化体系的建立42-45
• 3.1.1 杨树离体芽发生系统的建立42-43
• 3.1.2 杨树遗传转化体系的建立43-45
• 3.2 杨树离体芽发生过程中激素响应信号的分布模式45-49
• 3.2.1 生长素响应信号在杨树离体芽发生过程中的分布模式45-47
• 3.2.2 细胞分裂素反应调节因子编码基因在杨树离体芽发生过程中的表达模式47-49
• 3.3 细胞分裂素反应调节因子RR12和RR13调控杨树离体芽发生49-51
• 3.3.1 AmiR-RR12,13转基因株系的获得49-50
• 3.3.2 敲除RR12和RR13抑制了离体芽的发生50-51
• 3.4 细胞分裂素反应调节因子RR12和RR13调控杨树茎的次生生长51-54
• 3.4.1 RR12和RR13在杨树茎中的表达模式分析51-52
• 3.4.2 RR12和RR13调控杨树茎的次生生长52-54
• 4 讨论54-57
• 5 结论57-58
• 参考文献58-66
• 致谢66

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