miRNA-101a对山羊骨骼肌卫星细胞增殖与分化调控作用研究

发布时间：2017-04-10 17:31

  本文关键词：miRNA-101a对山羊骨骼肌卫星细胞增殖与分化调控作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：MicroRNAs (miRNAs)可以参与调控胚胎早期发育,细胞的增殖、分化和凋亡,肿瘤发生及脂类代谢等许多复杂的生物过程,且miRNA在生物体内的表达具有时空特异性。已有研究表明miRNA-101a (miR-101a)参与了细胞的增殖、分化过程的调控,但关于miR-101a对骨骼肌卫星细胞增殖与分化的调控机制尚不清楚。本研究扩增了山羊miR-101a的前体及侧翼序列,分析了miR-101a的组织表达及其对骨骼肌卫星细胞(SMSC)增殖、分化的影响。利用双荧光素酶报告基因检测系统验证了肌肉分化抑制基因EZH2与niR-101a结合的靶位点,并检测了过表达或抑制miR-101a对靶基因EZH2 mRNA表达水平的影响,初步揭示了miR-101a可能通过抑制靶基因的蛋白表达调控骨骼肌发育的分子机制。主要结果如下：1.山羊miR-101la的前体及侧翼序列448 bp,且成熟miR-101a在不同物种中序列高度保守,通过RNAfold软件在线分析表明山羊miR-101a前体符合microRNA结构特征。半定量PCR和荧光定量PCR (RT-qPCR)结果显示]miR-101a在臂三头肌、背最长肌、半膜肌和腰大肌等肌肉组织中的表达量高于心、肝、脾、肺和肾等其他5个内脏组织。2. RT-qPCR检测结果显示Pax7 mRNA在体外培养的SMSC增殖阶段表达量高,分化过程中表达量显著下降(P0.05); MyoD在增殖及分化初期表达量高；MyoG在分化融合的第三天表达量最高；而MyHC在分化融合过程中表达量逐渐升高。RT-qPCR检测miR-101a在SMSC分化0d、1d、3d、5d、7d的表达量,发现miR-101a在SMSC分化过程中表达量随着分化时间的延长显著增加(P0.05)。3.过表达或抑制miR-101a后诱导SMSC分化48 h,荧光定量PCR检测肌肉标志基因Pax7、MyoD、MyoG、MyHC mRNA的表达变化,结果显示：过表达miR-101a后,与对照组相比MyoG和MyHC基因表达量显著提高(P0.01), Pax7和MyoD基因表达量显著下降(P0.05)；抑制miR-101a后MyoG(P0.01)和MyHC(P0.05)基因表达量显著下降,Pax7(P0.01)和MyoD(P0.05)基因表达量显著增加,上述结果表明miR-101a能促进SMSC的分化。4.过表达或抑制miR-101a后应用CCK-8细胞增殖和毒性检测试剂分析miR-101a对SMSC增殖的影响,发现过表达或抑制miR-101a与NC对照组相比对细胞增殖的影响不显著(P0.05)。5.选用PicTar、TargetScan和miRanda软件预测miR-101a的靶基因,筛选出候选靶基因EZH2(肌细胞分化抑制基因),成功构建PGL3-Control-EZH2报告载体。通过双荧光素酶报告基因检测系统验证了靶EZH2的3'-UTR区含有与miR-101a作用的靶位点。6. RT-qPCR检测在SMSC分化Od、1d、3d、5d和7d靶基因EZH2 mRNA的表达水平,及过表达或抑制miR-101a诱导SMSC分化48 h后,EZH2 mRNA的表达量,结果显示：靶基因EZH2在细胞分化过程中的表达量下调,而过表达或抑制miR-101a后,与对照组相比EZH2 mRNA表达量变化不显著(P0.05),表明miR-101a可能是通过调控靶基因EZH2的蛋白水平来促进骨骼肌分化的。
【关键词】：miRNA-101a 山羊 骨骼肌卫星细胞增殖与分化 EZ
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 符号说明9-12
• 1 文献综述12-21
• 1.1 肌肉形成概述12-15
• 1.1.1 骨骼肌发生和发育12-13
• 1.1.2 骨骼肌生长发育相关的转录调控因子13-15
• 1.2 MicroRNA15-18
• 1.2.1 MicroRNA定义及产生机制15-16
• 1.2.2 MicroRNA作用机理16
• 1.2.3 MicroRNA与small interfering RNA的区别16-17
• 1.2.4 MicroRNA的检测方法17-18
• 1.2.5 MicroRNA靶标预测及鉴定18
• 1.3 参与调控骨骼肌发育的microRNAs18-20
• 1.4 miRNA-101a的研究进展20-21
• 1.5 本研究的目的和意义21
• 2 材料与方法21-37
• 2.1 试验材料21-28
• 2.1.1 山羊组织及血液样品21
• 2.1.2 菌株、细胞和载体21-23
• 2.1.3 主要试剂23-24
• 2.1.4 主要试剂的配制24-26
• 2.1.5 主要仪器26
• 2.1.6 主要分子生物学软件及数据库26-28
• 2.2 试验方法28-37
• 2.2.1 技术路线28-29
• 2.2.2 山羊miR-101a前体及侧翼序列的扩增及生物信息学分析29
• 2.2.3 miR-101a在山羊不同组织的表达规律分析29-31
• 2.2.4 细胞培养31-32
• 2.2.5 SMSCs的HE染色及融合率的评估32
• 2.2.6 细胞转染32-33
• 2.2.7 细胞增殖试验33
• 2.2.8 miRNA及肌细胞标志基因的表达量分析试验33-36
• 2.2.9 双荧光素酶报告试验36-37
• 3 结果与分析37-51
• 3.1 山羊miR-101a的克隆及结构分析37-39
• 3.1.1 miR-101a的克隆及测序37-38
• 3.1.2 山羊miR-101a的结构分析38-39
• 3.2 miR-101a在山羊不同组织间的表达谱39-40
• 3.3 SMSC分化模型的建立40-42
• 3.4 SMSC分化过程中miR-101a的表达42
• 3.5 miR-101a对SMSC分化的影响42-45
• 3.5.1 转染效率的检测42-43
• 3.5.2 过表达miR-101a促进SMSC分化43-44
• 3.5.3 抑制miR-101a阻碍SMSC分化44-45
• 3.6 miR-101a对SMSC增殖的影响45-47
• 3.6.1 过表达miR-101a对SMSC增殖的影响46
• 3.6.2 抑制miR-101a对SMSC增殖的影响46-47
• 3.7 miR-101a靶基因的预测结果47-48
• 3.8 miR-101a靶基因EZH2的载体构建与测序48-49
• 3.9 双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-101a靶标基因EZH249-50
• 3.10 miR-101a对骨骼肌卫星细胞内源性EZH2的调控50-51
• 4 讨论51-56
• 4.1 MicroRNA的表达及检测51-52
• 4.2 MicroRNA对细胞分化的影响52-54
• 4.3 MicroRNA mimic或inhibitor的使用54
• 4.4 MicroRNA靶基因的鉴定54-56
• 5 结论56-57
• 参考文献57-65
• 攻读学位期间发表的学术论文目录65-66
• 致谢66

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1 李丹丹;miRNA-101a对山羊骨骼肌卫星细胞增殖与分化调控作用研究[D];四川农业大学;2015年

  本文关键词：miRNA-101a对山羊骨骼肌卫星细胞增殖与分化调控作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：297209