氨基脲对斑马鱼（Danio rerio）的抗雌激素效应机制研究

发布时间：2017-04-10 14:23

  本文关键词：氨基脲对斑马鱼（Danio rerio）的抗雌激素效应机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来,新型污染物氨基脲(semicarbazide,SEM)主要存在于婴儿食品、果汁、果酱、蜜饯等日常食品中,而在液体牛奶、面粉等食品中也检出氨基脲残留。2009年9月我国东营潮河入海口及邻近海域海水的氨基脲含量高达46.41 μg/L,贝类等生物体内氨基脲平均含量为3.14-6.46μg/kg,超过欧盟对动物源性食品中氨基脲残留的限量值1.0μg/kg.由此可见,氨基脲不但威胁人类的食品安全,也对我国海洋生态环境造成了严重危害。已有的研究发现,氨基脲在哺乳动物和鱼体内发挥潜在的抗雌激素效应,例如降低雌性大鼠血浆E2水平,抑制雌性斑马鱼肝脏中雌激素受体(estrogen receptor α,ERα)基因和卵黄原蛋白1 (vitellogenin-1,vtg-1)基因的表达,但是氨基脲发挥以上抗雌激素效应的机制尚不明确。因此,本文采用氨基脲暴露性成熟的成年斑马鱼,以斑马鱼性腺组织性激素含量为指标,明确氨基脲在成年斑马鱼体内是否通过拮抗17p-雌二醇(17β-estradiol,E2)水平发挥抗雌激素效应；其次在类固醇合成酶的基因表达水平以及下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus-pituitary-gonad axis,HPG轴)对E2的调控两方面从E2合成的角度探究氨基脲对斑马鱼的抗雌激素效应机制。本研究结果表明：(1) 1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L氨基脲暴露成年雌性斑马鱼96h/28d,采用同位素放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)检测斑马鱼性腺中性激素含量,结果表明：96h的暴露实验发现,卵巢E2水平在10μg/L浓度组出现极显著降低；28d的暴露结果显示,雌鱼卵巢E2水平在1μg/L氨基脲浓度组显著降低。另外,本实验室另一位博士生的研究结果发现1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L氨基脲暴露成年雌性斑马鱼96h/28d能够抑制血浆中E2水平。因此我们认为氨基脲主要是通过抑制雌性斑马鱼卵巢内E2的合成,拮抗E2水平,发挥抗雌激素效应。(2) 1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/LL氨基脲暴露成年雌性斑马鱼96h/28d,采用实时定量PCR检测类固醇合成关键酶P450scc、P450c17、3β-HSD、 P450aromA的基因表达量变化,结果表明：96h的暴露结果表明,1μg/L、10μg/L、 100μg/L、100μg/L氨基脲暴露对卵巢3β-HSD1、P450c17、P450scc的表达均未产生显著影响,450aromAmRNA表达水平在1、10、100μg/L浓度组显著降低；28d的暴露结果显示,卵巢P450aromA、P450c17、P450sccmRNA表达水平与对照组相比在不同浓度组均表现出不同程度降低,而3β-HSD1基因表达量无显著变化。因此,我们认为氨基脲能够下调雌鱼卵巢细胞色素氧化酶的表达(主要是作用于限速酶P450aromA),抑制卵巢E2的合成。此外,E2与1μg/L、10μg/L、 100μg/L、1000μg/L氨基脲联合暴露成年雄性斑马鱼96h/28d的结果表明：96h的联合暴露实验结果表明,氨基脲与E2联合暴露相比E2单独处理组主要在不同浓度降低类固醇合成酶基因P450aromA、P450sccmRNA表达水平。氨基脲与E2联合暴露雄性斑马鱼28d的结果显示,与E2单独处理组相比,E2与氨基脲的联合暴露能够在不同浓度下降低P450aromA、P450c17、P450sccmRNA表达水平。联合暴露的实验结果表明,氨基脲主要是通过拮抗外源添加E2在成年雄性斑马鱼体内引起的芳香化酶表达量的上调,进而发挥抗雌激素效应。(3)1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L氨基脲暴露成年雌性斑马鱼96h/28d,采用实时定量PCR检测HPG轴上调控E2合成的相关因子FSHβ、LHβ、sGnRH、 P450aromB基因表达量,结果表明：96h/28d的结果显示,1μg/L、10μg/L氨基脲暴露显著降低雌性斑马鱼脑中sGnRH、FSHβ基因表达量。因此,我们认为氨基脲通过下调下丘脑sGnRH的表达降低垂体中FSHβmRNA的表达水平,进而抑制芳香化酶的活性。此外,E2与1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L的氨基脲联合暴露成年雄性斑马鱼96h/28d的结果显示：96h的暴露实验发现,E2与1μg/L、10μg/L氨基脲联合暴露相比E2单独处理组显著降低sGnRHmRNA的表达水平；28d的结果显示,与E2单独处理组相比,E2与1μg/L氨基脲联合暴露导致雄性斑马鱼脑中FSHfi、LHβ、sGnRHmRNA的表达水平较E2单独处理组均显著降低,因此我们认为氨基脲主要是通过拮抗外源添加E2在成年雄性斑马鱼脑中引起的sGnRH、FSHfi表达量的上调,发挥其抗雌激素效应。综上,通过我们的实验结果发现,氨基脲发挥抗雌激素效应的机制是通过抑制斑马鱼下丘脑中HPG轴起始因子sGnRH的表达,进一步下调垂体FSHmRNA的表达水平,进而抑制卵巢中细胞色素氧化酶P450家族(主要是P450aromA)基因表达量,最终抑制卵巢E2的合成,拮抗E2水平,发挥抗雌激素效应。
【关键词】：氨基脲 抗雌激素效应机制 17β-雌二醇 类固醇合成酶 下丘脑-垂体-性腺轴
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X503.22;S917.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 0 前言12-14
• 1 环境污染物的抗雌激素效应及机制研究进展14-26
• 1.1 具有抗雌激素效应的环境污染物14-16
• 1.2 环境污染物的抗雌激素效应16-17
• 1.2.1 拮抗E_2水平16
• 1.2.2 拮抗E_2的功能16-17
• 1.2.3 拮抗雌性性征17
• 1.3 环境污染物的抗雌激素效应机制17-23
• 1.3.1 干扰E_2合成17-19
• 1.3.2 干扰E_2的运输19
• 1.3.3 干扰E_2与相应受体结合19-22
• 1.3.4 干扰E_2代谢22-23
• 1.4 研究展望23-24
• 1.4.1 以孕激素为指标研究抗雌激素效应23
• 1.4.2 从神经内分泌角度研究抗雌激素效应23-24
• 1.4.3 从HPA、HPT、HPG轴的交互作用角度研究抗雌激素效应24
• 1.5 研究目的与技术路线24-26
• 2 氨基脲对斑马鱼的抗雌激素效应26-37
• 2.1 材料与方法26-30
• 2.1.1 实验材料26-27
• 2.1.2 实验药品与仪器27
• 2.1.3 实验方法27-30
• 2.1.4 数据处理30
• 2.2 结果30-34
• 2.2.1 96h暴露实验结果30-32
• 2.2.2 28d暴露实验结果32-34
• 2.3 讨论34-36
• 2.4 小结36-37
• 3 从性激素相关合成酶的角度探讨氨基脲的抗雌激素效应机制37-50
• 3.1 材料与方法38-41
• 3.1.1 实验材料38
• 3.1.2 实验药品与仪器38-39
• 3.1.3 实验方法39-40
• 3.1.4 数据处理40-41
• 3.2 结果41-47
• 3.2.1 96h暴露实验结果41-44
• 3.2.2 28d暴露实验结果44-47
• 3.3 讨论47-49
• 3.4 小结49-50
• 4 从HPG轴对E_2调控的角度探讨氨基脲的抗雌激素效应机制50-63
• 4.1 材料与方法51-52
• 4.1.1 实验材料51
• 4.1.2 实验药品与仪器51
• 4.1.3 实验方法51-52
• 4.1.4 数据处理52
• 4.2 结果52-58
• 4.2.1 96h暴露实验结果52-55
• 4.2.2 28d暴露实验结果55-58
• 4.3 讨论58-61
• 4.4 小结61-63
• 5 结论与创新63-64
• 5.1 结论63
• 5.2 创新点63-64
• 参考文献64-73
• 缩略词对照表73-75
• 致谢75-76
• 个人简历76
• 发表的学术论文76

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本文编号：296911