稳定表达αvβ3细胞系的建立及其对口蹄疫病毒易感性的评价
发布时间：2017-04-14 12:09
本文关键词：稳定表达αvβ3细胞系的建立及其对口蹄疫病毒易感性的评价，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)是单股正链RNA病毒,属于微RNA病毒科口蹄疫病毒属成员,FMDV对偶蹄动物高度致病,包括牛、水牛、猪、山羊、绵羊及多种野生物种。病毒识别受体是病毒感染的第一步,决定着病毒感染细胞的类型和宿主嗜性。FMDV可以识别不同受体,然后介导不同的路径进入细胞。FMDV通过识别位点RGD结合整联蛋白受体(αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8)后,通过网格蛋白介导的内吞路径进入细胞;FMDV还可以同VP3第56位精氨酸(VP3056R)结合硫酸乙酰肝素受体,通过小窝蛋白介导的内吞路径进入细胞。整联蛋白受体除了介导病毒感染作用外,还具有介导或激发信号转导等多种作用,这些功能参与病毒的致病机制还不清楚。因此,本研究为了揭示单个受体对病毒感染和信号介导的作用,构建单个受体细胞系,为进一步深入研究奠定基础。本研究克隆了整联蛋白受体αvβ3基因,并构建了稳定表达αvβ3的CHO-677-αvβ3细胞系,并评价了对口蹄疫病毒的易感性,具体内容如下:(1)αv和β3亚基的克隆:从乳鼠肺组织中分别提取了整联蛋白受体αv和β3亚基基因组总RNA,根据GenBank中已公布的整联蛋白αv和β3亚基基因序列,分别设计合成两对特异性引物,RT-PCR扩增出鼠源整联蛋白αv和β3亚基基因,产物经胶回收纯化后分别与p GEM-T载体相连,构建重组质粒,并进行多序列比对分析。结果表明,鼠源整联蛋白αv亚基基因全长3135bp,编码1045个氨基酸,β3亚基基因全长2364bp,编码788个氨基酸。序列同源性比较发现,鼠源αv亚基基因与人、猪同源性较高,而β3亚基基因与牛和绵羊的同源性较高。(2)αv和β3蛋白表达及其多抗的制备:将扩增的αv和β3部分胞外域基因分别与原核表达载体pET-30a相连,构建原核表达质粒,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组融合蛋白。通过SDS-PAGE鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,以Western blot鉴定血清特异性。结果显示,实现了重组融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量分别为40 kDa和40 k Da,主要以包涵体形式存在于菌体中,该血清可与目的蛋白发生特异性反应。(3)稳定表达αvβ3细胞系建立:用高效慢病毒介导的基因转导技术,构建了稳定表达αvβ3异二聚体的CHO-677细胞系,用PCR和IFA分别从基因和蛋白水平检测了第二十代细胞系中αv和β3亚基的表达,表明该基因已经成功的导入CHO-677细胞并稳定表达。(4)对口蹄疫病毒易感性的评价:为了评价该细胞系对口蹄疫病毒易感性,用蚀斑实验、TCID50、实时荧光定量和间接免疫荧光实验比较分析口蹄疫病毒在细胞系和亲本细胞上的生物学特性差异,结果表明感染FMDV/O/ZK/93之后,与亲本细胞相比,CHO-677-αvβ3细胞系上病毒RNA水平和蛋白表达量显著提高。数据表明成功构建了稳定表达αvβ3的细胞系,并可增加对口蹄疫病毒的易感性。
【关键词】：口蹄疫病毒 整联蛋白 αvβ3 CHO-677细胞系
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：
- 摘要5-6
- Abstract6-11
- 英文缩略表11-12
- 第一章 引言12-21
- 1.1 研究背景、目的和意义12
- 1.2.蹄疫概述12-14
- 1.2.1.蹄疫病毒分离及病毒亚型特性13-14
- 1.2.2.蹄疫病毒基因组及结构14
- 1.3.蹄疫病毒受体研究进展14-19
- 1.3.1.蹄疫病毒 αvβ3 整联蛋白受体15-16
- 1.3.2.蹄疫病毒 αvβ6 整联蛋白受体16-17
- 1.3.3.蹄疫病毒 αvβ1 整联蛋白受体17-18
- 1.3.4.蹄疫病毒 αvβ8 整联蛋白受体18
- 1.3.5.蹄疫病毒硫酸乙酰肝素（HS）受体18
- 1.3.6.蹄疫病毒新受体18-19
- 1.4 整联蛋白 αvβ3 功能研究进展19-21
- 1.4.1 介导血管生成19
- 1.4.2 介导肿瘤生长19-20
- 1.4.3 介导细胞凋亡20
- 1.4.4 介导细胞粘附20-21
- 第二章 .蹄疫病毒鼠源整联蛋白受体 αv和 β3 基因的克隆及分析21-29
- 2.1 材料与方法21-25
- 2.1.1 试验材料21
- 2.1.2 主要试剂及配制21-22
- 2.1.3 试验器材22
- 2.1.4 试验方法22-25
- 2.2 结果25-27
- 2.2.1 鼠源整联蛋白 αv和 β3 亚基基因PCR扩增25-26
- 2.2.2 重组质粒的双酶切鉴定26-27
- 2.2.3 基因序列分析27
- 2.3 讨论27-29
- 第三章 鼠源 αv和 β3 基因的原核表达及其多克隆抗体的制备29-37
- 3.1 材料与方法29-32
- 3.1.1 实验材料29
- 3.1.2 实验方法29-32
- 3.2 结果32-35
- 3.2.1 目的片段扩增32
- 3.2.2 重组表达质粒的鉴定32-33
- 3.2.3 诱导表达重组菌33-34
- 3.2.4 可溶性分析34
- 3.2.5 纯化重组蛋白34-35
- 3.2.6 鉴定多克隆抗体35
- 3.3 讨论35-37
- 第四章 鼠源整联蛋白CHO677αvβ3 细胞系的建立及鉴定37-44
- 4.1 材料与方法37-40
- 4.1.1 实验材料37
- 4.1.2 主要试剂37-38
- 4.1.3 试验方法38-40
- 4.2 结果40-42
- 4.2.1 慢病毒双表达载体的鉴定40
- 4.2.2 细胞系的鉴定40-41
- 4.2.3 病毒感染试验结果41-42
- 4.2.4 抗体阻断试验结果42
- 4.3 讨论42-44
- 第五章 全文结论44-45
- 参考文献45-52
- 附录52-56
- 致谢56-57
- 作者简历57
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