矮牵牛PhIDL基因的克隆及遗传转化研究

发布时间：2017-04-15 02:09

  本文关键词：矮牵牛PhIDL基因的克隆及遗传转化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：器官脱落(organ abscission)是指植物体的部分器官(花、叶、果等)脱离母体的生理过程。脱落一般发生在一个可预知的、由特殊形态细胞组成的部位—离区(abscission zone)。.离区的激活一直都是植物器官脱落研究的焦点,IDA基因是离区激活的必需基因。目前在拟南芥中已经明确的花器官脱落信号转导途径是Bopl/Bop2→IDA →HAE/HSL2→MKK4/MKK5→MAPK→花器官脱落。IDA基因已经在拟南芥、番茄、烟草、大豆进行了克隆和相应的功能研究,但在矮牵牛中还未见报道。本研究成功从矮牵牛花中分离克隆出了IDA基因,命名为PhIDL,主要结果如下：1. 利用EST数据库中矮牵牛的已知的序列设计引物,通过反转录分离克隆了PhIDL基因,PhIDL基因全长为381 bp.其中包括一个完整的开放阅读框为270 bp,编码89个氨基酸,全长序列还包括5’非编码区(5'UTR)长度15 bp,3’非编码区(3'UTR)长度为94 bp。NCBI库中的氨基酸序列,经比对发现：该序列与茄科烟草(Nicotiana tomentosiformis) 、番茄(Solarium lycopersicum) 、大豆(Glycine max)和毛果杨(Populus trichocarpa)的同源性分别为62%、49%、40%、42%,且氨基酸长度相似。2.PhIDL蛋白分子式为C436H681N111O127S10,该蛋白质的理论分子量为9830.4,等电点(pI)为8.8,总平均疏水指数(GRAVY)为-0.199,不稳定系数(instability index)为59.05,推测该蛋白质是一个不稳定的蛋白。该蛋白疏水性最大值约为2.8(第24个氨基酸),最小值约为-2.411(第58个氨基酸),其中第15-35位氨基酸区域的疏水区域比较明显。在第15-34位氨基酸处,该蛋白有一个跨膜区,与疏水性区域相称。该蛋白的亚细胞定位于细胞核内(nuclear) 。该蛋白的二级结构预测结果表明含32.58%α螺旋,15.73%p折叠,6.74%p转角,44.94%的无规则卷曲,是一种混合型蛋白。该蛋白不存在信号肽,为非分泌性蛋白；磷酸化位点预测表明PhIDL具有6个磷酸化位点。3.成功构建植物双元表达载体PhIDL-p2355,用冻融法将其导入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌介导遗传转化野生型烟草和拟南芥。经卡那(Kana)抗性筛选和PCR检测,已经成功获得转基因植株。
【关键词】：矮牵牛 器官脱落 基因克隆 遗传转化
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S681.9
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 英文缩写表7-10
• 1 文献综述10-17
• 1.1 脱落概述10
• 1.2 花器官脱落过程研究进展10-16
• 1.2.1 离区的分化10-12
• 1.2.2 离区的激活及相关基因的研究12-15
• 1.2.3 离区细胞的分离及保护层的形成15-16
• 1.3 研究的目的、意义16-17
• 2 PhIDL基因的克隆及生物信息学分析17-33
• 2.1 材料与方法17-22
• 2.1.1 植物材料、主要试剂及仪器设备17-18
• 2.1.2 方法18-22
• 2.2 结果与分析22-33
• 2.2.1 矮牵牛花RNA的质量检测22-23
• 2.2.2 PhIDL基因全长的克隆23-24
• 2.2.3 矮牵牛PhIDL基因的生物信息学分析24-33
• 3 农杆菌介导的PhIDL对烟草的遗传转化33-44
• 3.1 实验材料及主要试剂33-34
• 3.2 仪器设备：同2.1.134
• 3.3 实验方法34-39
• 3.3.1 矮牵牛PhIDL基因植物双元表达载体的构建34-36
• 3.3.2 CaCl_2法制备农杆菌感受态36
• 3.3.3 植物双元表达载体质粒PhIDL-p2355冻融法转农杆菌感受态细胞36-37
• 3.3.4 农杆菌介导的PhIDL基因转化烟草37-39
• 3.4 结果与分析39-44
• 3.4.1 矮牵牛PhIDL基因植物双元表达载体的构建39-41
• 3.4.2 植物双元表达载体质粒PhIDL-p2355转化农杆菌41-42
• 3.4.3 农杆菌介导的PhIDL基因转入烟草42-43
• 3.4.4 转基因烟草的PCR检测43-44
• 4 农杆菌介导的PhIDL对拟南芥的遗传转化(蘸花法)44-48
• 4.1 实验材料及试剂44
• 4.2 实验方法44-46
• 4.2.1 拟南芥种植44-45
• 4.2.2 拟南芥蘸花45
• 4.2.3 抗性筛选转基因拟南芥植株45-46
• 4.3 结果与分析46-48
• 4.3.1 拟南芥的蘸花与筛选抗性植株46-47
• 4.3.2 转基因拟南芥的PCR检测47-48
• 5 讨论与结论48-51
• 5.1 矮牵牛PhIDL基因的克隆48
• 5.2 矮牵牛PhIDL基因的序列特征及所编码的蛋白质基本性质48-49
• 5.3 PhIDL基因对烟草的遗传转化49-50
• 5.4 PhIDL基因对拟南芥的遗传转化50-51
• 6 研究展望51-52
• 参考文献52-57
• 致谢57

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本文编号：307351