猪札幌病毒主要非结构蛋白的表达及VP2互作分子的筛选

发布时间：2017-04-16 08:02

  本文关键词：猪札幌病毒主要非结构蛋白的表达及VP2互作分子的筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：札幌病毒又名札如病毒,属于杯状病毒科札幌病毒属,是人和动物病毒性急性胃肠炎的主要病原体之一。主要通过粪-口途径传播,引起轻微腹泻或急性腹泻并伴有恶心、呕吐和腹痛等症状。近年来研究发现,札幌病毒不仅感染人,而且感染猪、牛、狗、猫、蝙蝠、水貂和海狮等动物。猪札幌病毒最早于1980年在美国被发现,随后,在许多国家都发现了该病毒,给养猪业造成了一定的威胁和损失。中国最早于2008年从腹泻猪的粪便中分离出了该病毒,随后的研究发现,该病毒不仅存在于腹泻猪群中,而且在无症状猪群中也有一定的检出率,存在隐性带毒现象,对养猪业生产存在潜在威胁。因此全面了解该病毒的生物学特性,探究该病毒在引起仔猪尤其是断奶仔猪腹泻中所起的作用,对于降低经济损失、保障人类健康,具有重要的意义。本研究利用原核表达系统获得了猪札幌病毒CH430株VPg、3C、3D、p70和VP2 5种重组蛋白及其多克隆抗体,并利用酵母双杂交系统初步筛选出23种与VP2相互作用的已知蛋白。本研究首先采用一步法RT-PCR方法分别扩增猪札幌病毒CH430株VPg、3C、3D、p70、VP2目的片段,然后将这些目的片段分别亚克隆到pET-30a载体中,分别构建原核表达载体pET30a-VPg/3C/3D/p70/VP2,将其分别转化到表达菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳确定得到的重组蛋白大小分别为22、23、67、81、26 kDa,五种蛋白均主要以包涵体形式存在。采用Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化体系Ni-NTA亲和层析纯化方法进行纯化,获得浓度和纯度较高的VPg、3C、3D、p70、VP2重组蛋白,Western-blot鉴定表明VPg、3C、3D、p70、VP2重组蛋白均具有良好的抗原性;利用纯化的蛋白免疫家兔制备高免血清,能够得到高滴度的多克隆抗体,Western-blot检测表明,五种多克隆抗体均能特异性识别相应的重组蛋白,为进一步研究上述蛋白的功能奠定了基础。本研究进一步以猪小肠粘膜上皮组织为模型,构建其酵母双杂交cDNA文库转化入感受态Y187酵母细胞中。以猪札幌病毒VP2基因构建酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-VP2,并用醋酸锂法将其转化入Y2HGold酵母感受态细胞中,进行毒性检测和自激活检测;并将含有pGBKT7-VP2的Y2HGold酵母菌与猪小肠粘膜上皮组织cDNA文库Y187菌共培养,然后将杂交菌液通过4缺营养缺陷培养基筛选阳性克隆,并进行测序,用BLAST工具对测序结果进行同源性分析。结果表明诱饵质粒pGBKT7-VP2中的VP2蛋白在Y2HGold中获得表达,且不存在毒性和自激活现象。从猪小肠粘膜上皮组织cDNA文库中初步筛选到23个与VP2相互作用的已知蛋白,为进一步研究猪札幌病毒VP2的功能提供了新的线索,对猪札幌病毒分子致病机制的研究具有重要意义。
【关键词】：猪札幌病毒 克隆 原核表达 纯化 酵母双杂交
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文缩略表11-12
• 第一章 引言12-21
• 1.1 札幌病毒的发现及命名12
• 1.2 生物学分类地位12-13
• 1.3 物理特性和稳定性13
• 1.4 基因结构及功能13
• 1.5 基因组序列和基因分型13-14
• 1.6 基因重组14-15
• 1.6.1 主要毒株的出现和演变14
• 1.6.2 重组毒株14-15
• 1.7 结构蛋白研究现状15
• 1.7.1 VP1的研究现状15
• 1.7.2 VP2的研究现状15
• 1.8 非结构蛋白研究现状15-16
• 1.9 细胞培养和动物感染实验16-17
• 1.10 传播途径和宿主易感性17
• 1.11 流行状况17-18
• 1.11.1 国外流行状况17
• 1.11.2 国内流行状况17-18
• 1.12 临床症状18
• 1.13 受体研究18
• 1.14 检测方法18-19
• 1.14.1 RT-PCR检测方法19
• 1.14.2 ELISA检测方法19
• 1.15 酵母双杂交系统19-20
• 1.16 目的与意义20-21
• 第二章 PoSaV CH430株VPg、3C、3D、p70和VP2的原核表达及多抗的制备21-34
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 菌种、毒株和载体21
• 2.1.2 实验动物21
• 2.1.3 主要试剂21-22
• 2.1.4 仪器设备22
• 2.1.5 培养基及溶液22-23
• 2.2 方法23-27
• 2.2.1 引物的设计与合成23
• 2.2.2 病毒总RNA的提取23-24
• 2.2.3 VPg、3C、3D、p70、VP2基因的RT-PCR扩增24
• 2.2.4 纯化回收VPg、3C、3D、p70、VP2基因24
• 2.2.5 VPg、3C、3D、p70、VP2基因与pMD19-T simple载体连接，构建重组质粒24
• 2.2.6 重组质粒的转化及菌落筛选24-25
• 2.2.7 质粒DNA提取25
• 2.2.8 重组质粒双酶切鉴定及目的基因序列测定25
• 2.2.9 原核表达质粒的构建25-26
• 2.2.10 VPg、3C、3D、p70、VP2蛋白表达26
• 2.2.11 表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定26
• 2.2.12 重组蛋白的可溶性分析26
• 2.2.13 重组蛋白的纯化26-27
• 2.2.14 兔源多抗的制备27
• 2.2.15 Western-blot分析27
• 2.2.16 ELISA测定超免疫血清的效价27
• 2.3 结果与分析27-32
• 2.3.1 VPg、3C、3D、p70、VP2基因的RT-PCR扩增27-28
• 2.3.2 重组pMD19T-VPg/3C/3D/p70/VP2质粒的鉴定28
• 2.3.3 重组原核表达载体pET30a-VPg/3C/3D/p70/VP2的鉴定28-29
• 2.3.4 重组蛋白的鉴定29-30
• 2.3.5 重组蛋白的可溶性分析30
• 2.3.6 重组蛋白的纯化30-31
• 2.3.7 Western-blot鉴定31-32
• 2.3.8 抗体效价的检测32
• 2.4 讨论32-34
• 第三章 酵母双杂交系统筛选与VP2相互作用的宿主蛋白34-43
• 3.1 材料34
• 3.1.1 实验动物34
• 3.1.2 菌株、表达载体及文库34
• 3.1.3 主要试剂34
• 3.2 方法34-36
• 3.2.1 cDNA文库的构建34-35
• 3.2.2 VP2蛋白基因的引物设计35
• 3.2.3 VP2蛋白基因的PCR扩增35
• 3.2.4 诱饵质粒pGBKT7-VP2的构建35
• 3.2.5 酵母双杂交试验35-36
• 3.3 结果与分析36-40
• 3.3.1 猪小肠上皮组织总RNA的提取及均一化cDNA文库的构建36-37
• 3.3.2 猪小肠粘膜上皮组织cDNA文库的鉴定37-38
• 3.3.3 诱饵蛋白VP2的毒性检测和自激活检测38-39
• 3.3.4 酵母双杂交筛选猪小肠粘膜上皮组织cDNA文库39
• 3.3.5 阳性克隆测序结果39-40
• 3.4 讨论40-43
• 第四章 全文结论43-44
• 参考文献44-51
• 致谢51-52
• 作者简历52

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 常昭瑞;靳淼;刘娜;谢华萍;崔淑娴;章青;段招军;;我国九省区2006年札如病毒流行状况及基因序列分析[J];病毒学报;2009年02期

2 吴芳姿;江大雄;莫之欣;;台湾地区首例沙波病毒腹泻群聚感染事件[J];海峡预防医学杂志;2008年02期

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1 吴刘亦文;颞叶癫痫大鼠模型PSD中SNX3的表达[D];中南大学;2009年

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本文编号：310351