海南金菠萝心腐病致病菌的分离鉴定及生防效应研究

发布时间：2017-04-16 03:18

  本文关键词：海南金菠萝心腐病致病菌的分离鉴定及生防效应研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：菠萝心腐病是造成菠萝减产的主要病害因素之一。防治措施一般是使用化学农药,但由于化学农药大量与长期使用会导致病菌的抗性增强和引起食品安全等问题。生物防治作为环保、安全的病害防治途径,筛选并研发针对菠萝心腐病害的新型杀菌剂成为当务之急。本研究从海南省乐东县心腐病发病严重的菠萝园中分离到一株致病菌-烟草疫霉-为目标菌株,分离筛选出对病原菌有较强拮抗作用的微生物,将筛选获得的拮抗菌与腐熟有机肥二次发酵,探究拮抗菌制成的生物有机肥对菠萝心腐病的防治效果,以期为菠萝心腐病的生物防治提供理论依据。主要研究结果如下： (1)从海南乐东万钟农场金菠萝心腐病发病植株分离到一株致病菌,采用柯赫氏法则对其致病性进行了回接验证,经18S rDNA序列分子测序并结合形态分析,鉴定该致病菌为烟草疫霉。该病菌菌丝生长最适宜的条件为pH6,温度25℃左右,Ca2+离子浓度在1-4g/L之间,V8汁琼脂和燕麦琼脂培养基最适合菠萝心腐病原菌菌丝的生长。 (2)从高发病地块的健康菠萝地、香蕉园等土壤中采集到31份土样,通过平板稀释分离得到224株细菌,以分离到的菠萝心腐病菌为对象,利用平板对峙法筛选到2株具有强拮抗功能的细菌,菌株编号为HL2、HL3,经鉴定,HL2菌株属于枯草芽孢杆菌,HL3菌株为链霉菌。抑菌试验结果表明这两株拮抗菌对菠萝心腐病病菌菌丝生长的抑制率分别为71.6%和53.3%,对病菌产孢子囊的抑制率分别为83.3%、61.7%；拮抗菌培养过程中产生的挥发性抑菌物质能明显抑制病原菌菌丝的生长,提取HL2拮抗菌发酵液中的抑菌物质并用液-质联用仪进行分析表明该抑菌物质主要是表面活性素(surfactin)和伊枯草菌素(iturin)。 (3)利用筛选出来的拮抗菌HL2和HL3与有机肥二次发酵制成生物有机肥B102和B103,采用高发病土进行金菠萝盆栽试验,结果表明B102不但能明显促进菠萝的生长,并且可以降低菠萝心腐病的发病率,其相对防效为73.5%。 (4)对施用生物有机肥(BIO2)的菠萝盆栽土壤可培养微生物的分析结果表明,施用B102菠萝苗根际土中细菌和放线菌数量显著高于对照处理(施用普通有机肥),真菌的数量低于对照。用DGGE分析土壤中微生物多样性表明,与对照相比,施用B102提高了菠萝根际土中的细菌数量和种类、均匀度指数、丰富度、辛普森指数、真菌的的均匀度,但是降低了土壤真菌的种类和数量。
【关键词】：菠萝心腐病 烟草疫霉 拮抗菌 生物有机肥 微生物多样性
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.68
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1. 引言9-17
• 1.1 菠萝心腐病的概述9-10
• 1.2 菠萝心腐病的防治概况10-14
• 1.2.1 抗、耐病品种的选育10-11
• 1.2.2 药剂防治11
• 1.2.3 农业防治11-12
• 1.2.4 生物防治12-14
• 1.3 拮抗微生物的防控机理14-16
• 1.3.1 拮抗作用14-15
• 1.3.2 竞争作用15
• 1.3.3 诱导抗性作用15
• 1.3.4 重寄生作用15-16
• 1.4 本研究的目的与意义16
• 1.5 本研究的技术路线16-17
• 2 材料与方法17-25
• 2.1 菠萝心腐病病原菌的分离、致病性验证及鉴定17-19
• 2.1.1 样品的采集17
• 2.1.2 供试植株17
• 2.1.3 菠萝心腐病病原菌的分离与致病性验证17
• 2.1.4 菠萝心腐病病原菌的保存与鉴定17-18
• 2.1.5 菠萝心腐病病原菌的生长条件测定18-19
• 2.2 菠萝心腐病拮抗菌的分离筛选与鉴定19-21
• 2.2.1 土壤样品的采集19
• 2.2.2 土壤细菌的分离与纯化19
• 2.2.3 拮抗菌的筛选19
• 2.2.4 拮抗菌对菠萝心腐病菌的抑制活性测定19-20
• 2.2.5 拮抗菌的鉴定20-21
• 2.3 拮抗菌HL2脂肽类物质的分离方法与分析条件21-22
• 2.3.1 脂肽类抑菌物质的提取与保存方法21
• 2.3.2 脂肽类抑菌物质的测定与分析条件21-22
• 2.4 生物有机肥对菠萝心腐病害的盆栽防控设计22-23
• 2.4.1 试验材料22
• 2.4.2 盆栽试验设计22
• 2.4.3 统计方法22-23
• 2.5 盆栽菠萝根际土壤微生物多样性的测定23-25
• 2.5.1 土壤样品的采集23
• 2.5.2 根际土中可培养微生物数量的测定23
• 2.5.3 土壤总DNA的提取23
• 2.5.4 细菌16S rDNA和真菌18S rDNA基因序列的扩增23-24
• 2.5.5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)24-25
• 3 结果与分析25-43
• 3.1 菠萝心腐病病原菌的分离鉴定25-29
• 3.1.1 菠萝心腐病病原菌的分离25
• 3.1.2 菠萝心腐病病原菌的鉴定结果25-27
• 3.1.3 菠萝心腐病病原菌菌丝的生长适宜条件27-29
• 3.2 菠萝心腐病菌拮抗菌的分离、筛选及鉴定29-33
• 3.2.1 菠萝心腐病菌拮抗菌的分离29-30
• 3.2.2 菠萝心腐病拮抗菌的筛选30
• 3.2.3 拮抗菌对心腐病病菌抑制能力的测定30-32
• 3.2.4 拮抗菌的鉴定结果32-33
• 3.3 HL2拮抗菌脂肽类物质的测定结果33-35
• 3.4 生物有机肥对菠萝心腐病的防效及对土壤微生物多样性的影响35-43
• 3.4.1 生物有机肥对盆栽菠萝植株发病率的影响35-36
• 3.4.2 生物有机肥对菠萝生长的影响36-37
• 3.4.3 生物有机肥对菠萝根际土壤微生物数量的影响37
• 3.4.4 生物有机肥对菠萝盆栽根际土壤微生物多样性的影响37-43
• 4 讨论43-45
• 4.1 菠萝心腐病病原菌43
• 4.2 菠萝心腐病的生物防治及机理43-45
• 4.2.1 脂肽类物质43-44
• 4.2.2 生物防治机理44-45
• 5 结论45-46
• 参考文献46-51
• 附录一 实验所用培养基51
• 附录二 拮抗菌HL2菌株16Sr DNA序列51-52
• 附录三 拮抗菌HL3菌株16Sr DNA序列52-53
• 致谢53

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