FPV复制非必需位点的筛选及重组病毒生物学特性比较

发布时间：2017-04-26 23:06

  本文关键词：FPV复制非必需位点的筛选及重组病毒生物学特性比较，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鸡痘病毒(Fowlpox Virus,FPV)基因组庞大,其基因组由260~309 kb双链DNA组成,含有大量的复制非必需区可以作为外源基因的插入位点,可以容纳25~30 kb的外源基因。而且,FPV只对禽类有感染性,病毒不能在哺乳动物体内增殖,使得FPV作为载体有很好的生物安全性。FPV作为动物病毒的表达载体表现出了其独特的优越性。以FPV为载体的重组病毒活载体疫苗在近二十多年来取得了很大的进展,特别是一些如禽流感、新城疫、传染性喉气管炎、传染性支气管炎、传染性法氏囊病及马立克氏病等引起禽类疾病的病毒的保护性抗原基因已经在FPV上成功表达。构建以FPV为载体的重组病毒的过程中,首先要做的就是对病毒复制非必需区的选择。但是,现在国内在FPV重组位点的选择上研究还比较少,而且重组位点的选择会影响到重组病毒的复制能力及外源基因的表达水平。因此,筛选并优化以我国的FPV疫苗株为基础的复制非必需区是至关重要的,这也对以后构建高效安全的重组FPV载体疫苗奠定基础。本研究采用定向克隆的方法筛选FPV的复制非必需区。在复制非必需区的选择上,尽量以不影响FPV的复制、毒力及生物学特性为基础。为筛选高效的FPV基因组外源基因的插入位点,本研究选择FPV的FPV054基因内部及FPV161与FPV162之间的基因间隔区作为重组位点,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的转移载体,以表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组FPV(rFPV-gB)为亲本病毒,通过在鸡胚成纤维细胞(CEF)中同源重组,制备表达绿色荧光蛋白报告基因的重组鸡痘病毒,经过3轮蚀斑纯化筛选获得能够稳定表达EGFP的重组病毒,分别命名为rFPV054-EGFP和rFPV161-EGFP。将重组病毒与亲本病毒连续传代20代,通过对每5代病毒的PCR鉴定,检测到外源基因在病毒的传代过程中始终存在,且没有发生改变;同时,对外源基因表达的免疫印记检测也进一步证明了所表达的蛋白的抗原性;通过对每代病毒所感染的细胞的荧光观察,发现绿色荧光蛋白基因能稳定持续表达。复制动力学比较证明重组病毒与亲本毒株生长特性相似;对重组病毒及亲本病毒病毒粒子的电镜观察证明两者在形态结构上相似;在CEF细胞上形成的蚀斑比较证明重组病毒与亲本病毒形成的蚀斑大小及形状相似。本研究获得的两个复制非必需位点,为一个或多个其他动物(禽病或哺乳动物)病原的保护性抗原基因的插入提供了实验基础。为进一步构建二价或多价疫苗,真正做到一次免疫同时防治多种疾病,提供广阔的应用前景。
【关键词】：重组FPV 复制非必需区 外源基因 生物学特性
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 1 引言13-22
• 1.1 鸡痘病毒13-14
• 1.1.1 形态结构13-14
• 1.1.2 理化特性14
• 1.1.3 宿主范围14
• 1.2 FPV的基因组14-17
• 1.2.1 病毒的开放阅读框15
• 1.2.2 末端反向重复序列15-16
• 1.2.3 FPV的功能基因16-17
• 1.3 FPV载体系统的最新研究进展17-20
• 1.3.1 FPV重组病毒的早期历史17
• 1.3.2 重组FPV在禽类上的应用17-18
• 1.3.3 重组FPV的构建18-20
• 1.4 重组FPV的应用前景20
• 1.5 研究的目的与意义20-22
• 2 材料和方法22-34
• 2.1 材料22-24
• 2.1.1 毒株与细胞22
• 2.1.2 菌株和质粒22
• 2.1.3 主要试剂22-23
• 2.1.4 主要仪器设备23
• 2.1.5 部分溶液的配制方法23-24
• 2.2 方法24-34
• 2.2.1 病毒的扩增与基因组的提取24
• 2.2.2 引物的设计24-25
• 2.2.3 转移载体的构建25-29
• 2.2.4 接毒及转染29-30
• 2.2.5 重组病毒的筛选与纯化30
• 2.2.6 两株重组病毒的鉴定30-31
• 2.2.7 重组病毒与亲本病毒的生物学特性比较31-34
• 3 结果34-47
• 3.1 两个转移载体质粒的构建34-38
• 3.1.1 两侧同源臂及EGFP基因的PCR扩增34
• 3.1.2 pMD18-T-同源臂质粒的构建与鉴定34-36
• 3.1.3 pUC18与同源臂构建与鉴定36-37
• 3.1.4 pSY-EGFP质粒的构建与鉴定37
• 3.1.5 两个转移载体质粒的构建37-38
• 3.2 两个转移载体的转染38-39
• 3.3 重组病毒的筛选及纯化39
• 3.4 重组病毒的PCR鉴定39-40
• 3.5 重组病毒的外源基因表达鉴定40-41
• 3.6 重组病毒与亲本病毒的生物学特性比较41-47
• 3.6.1 重组病毒与亲本病毒形态观察41-43
• 3.6.2 两株重组病毒与亲本病毒蚀斑比较43
• 3.6.3 重组病毒传代过程外源基因稳定性检测43-44
• 3.6.4 外源基因表达的稳定性44-45
• 3.6.5 重组病毒与亲本病毒毒价比较45
• 3.6.6 重组病毒与亲本病毒生长曲线比较45-47
• 4 讨论47-49
• 5 全文结论49-50
• 参考文献50-56
• 致谢56-57
• 作者简介57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 杨明凡;崔保安;陈红英;王学斌;魏战勇;;传染性喉气管炎病毒gD基因重组禽痘病毒的制备、纯化及初步鉴定[J];中国生物制品学杂志;2009年04期

2 朱羿龙;李昌;刘存霞;杜寿文;王茂鹏;叶飞;谭鹏;邢彬;刘继;朱光泽;郭焱;金宁一;;表达猴免疫缺陷病毒Env蛋白的重组鸡痘病毒的构建和筛选[J];生物技术通讯;2014年03期

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4 沈瑞忠，袁世山，刘桂永，金红，崔治中，卢景良;鸡痘病毒复制非必需区的筛选及酶切分析[J];中国畜禽传染病;1995年03期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

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本文编号：329402