鸭疫里默氏菌ragB基因的生物信息学分析和克隆表达

发布时间：2017-05-10 04:14

  本文关键词：鸭疫里默氏菌ragB基因的生物信息学分析和克隆表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鸭疫里默氏菌(Riemerella antipestifer, RA)是一种能引起鸭、鹅、火鸡等多种禽类发生急性或者慢性败血性经过的接触性传染病的感染病原。该病是目前阻碍养鸭业生产的重要疾病之一。本研究通过生物信息学分析血清1型RA基因组序列比对出RA CH-1株的受体抗原B蛋白基因ragB (Genbank登录号：CP003787.1),选择pET-32a(+)原核表达载体对该基因进行克隆表达,主要结果如下：1 RA ragB基因的生物信息学分析RA ragB基因全长1593bp, G+C含量为35.72%。该基因含有一个ORF,即ORF1593。密码子有效数(effective number of codons, ENC)为38.491,稀有密码子个数为43,含有3个密码子二联体(AGAATA、AGAAGA、ATA ATA)但不含有连续的2个以上的稀有密码子串。密码子偏爱性分析结果显示该基因的偏嗜密码子中,其第三位碱基大多为T碱基(8个)或者A碱基(12个)。RA ragB基因有25个密码子的使用频率与大肠杆菌的密码子使用频率具有显著差异；有26个密码子与酵母菌密码子使用频率具有显著差异；有30个密码子与人的密码子使用频率具有显著差异。所以优先选择大肠杆菌原核表达系统作为RA RagB蛋白的异源表达系统。RA RagB蛋白由530个氨基酸编码大小为58.97 kDa的蛋白,等电点(pI)为5.716。该蛋白有信号肽切割位点,没有跨膜区,抗原表位主要集中在60-77、186～201、251-269、387～403、495～513位氨基酸。蛋白功能位点预测：有N-糖基化位点2个(16、450),蛋白激酶C磷酸化位点5个(110、147、273、303、474),酪蛋白激酶II磷酸化位点3个(20、373、399), N-豆蔻酰化位点9个(56、73、319、328、334、393、445、473、496),酪氨酸激酶磷酸化位点2个(255、438),cAMP和cGMP依赖性位点1个(255)。亚细胞定位分析该蛋白主要分布于细胞膜上。氨基酸进化树分析表明该蛋白与黄杆菌科编码RagB蛋白的其它成员相似性较低。2 RA ragB基因的克隆表达用Oligo7.1对RA ragB基因设计了一对PCR引物,扩增片段大小为1623 bp,构建pMD19-T-ragB克隆载体,鉴定正确后再双酶切与表达质粒连接构建pET-32a-ragB原核表达质粒,将表达质粒转入表达菌株E.coli BL21内,在37℃,终浓度为0.8mmol/L的IPTG诱导10h的条件下重组蛋白能够大量表达。经SDS-PAGE分析蛋白大小约80 kDa,免疫印迹Western blot检测该蛋白可被兔抗RA CH-1阳性血清识别,表明该蛋白具有很好的反应原性。
【关键词】：鸭疫里默氏菌 ragB基因 生物信息学分析 原核表达
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-6
• 英文缩写词汇及其含义说明6-9
• 第一部分 序言9-14
• 1 RA研究概况9
• 2 RagB基因的研究进展9-13
• 3 研究的目的和意义13-14
• 第二部分 试验内容14-43
• 1 材料14-17
• 1.1 菌株、菌种、质粒14
• 1.2 试剂14
• 1.3 主要溶液的配制14-16
• 1.3.1 培养基的配制14-15
• 1.3.2 DNA提取相关试剂的配制15
• 1.3.3 核酸电泳相关试剂的配制15
• 1.3.4 抗生素及其培养基的配制15
• 1.3.5 SDS-PAGE相关试剂的配制15-16
• 1.3.6 Western blot相关试剂的配制16
• 1.4 主要仪器设备16-17
• 2 方法17-23
• 2.1 鸭疫里默氏菌ragB基因的生物信息学分析17-18
• 2.1.1 RAragB基因的核苷酸序列分析17
• 2.1.2 RAragB基因的密码子偏爱性分析17-18
• 2.1.3 RARagB蛋白质的组分分析18
• 2.2 RA ragB基因原核表达18-23
• 2.2.1 RAragB基因扩增18-19
• 2.2.2 重组T克隆质粒pMD19-T-ragB的构建及鉴定19-20
• 2.2.3 原核表达质粒pET-32a-ragB的构建和鉴定20-21
• 2.2.4 重组表达质粒pET-32a-ragB表达菌的诱导表达及条件优化21-22
• 2.2.5 表达蛋白的Western-blot鉴定22-23
• 3 结果23-40
• 3.1 鸭疫里默氏菌ragB基因的生物信息学分析23-36
• 3.1.1 RA ragB核苷酸序列分析23
• 3.1.2 RA ragB基因的密码子偏爱性分析23-30
• 3.1.3 RA RagB蛋白质的组分分析30-31
• 3.1.4 信号肽切割位点和跨膜区预测31
• 3.1.5 抗原性和疏水性分析31-33
• 3.1.6 功能位点预测33-34
• 3.1.7 蛋白质亚细胞定位分析34
• 3.1.8 二级结构预测与密码子氨基酸序列保守结构域预测34-36
• 3.2 RA ragB基因的克隆表达及Western blot检测36-40
• 3.2.1 RA ragB基因的扩增36
• 3.2.2 重组T克隆质粒pMD19-T-ragB的构建及鉴定36
• 3.2.3 原核表达质粒pET-32a-ragB的构建和鉴定36-37
• 3.2.4 RagB重组蛋白的诱导表达37-39
• 3.2.5 RagB重组蛋白的Western blot检测39-40
• 4 讨论40-43
• 4.1 鸭疫里默氏菌ragB基因的生物信息学分析40-41
• 4.2 RA RagB基因的原核表达和Western blot检测41-43
• 小结43-45
• 参考文献45-49
• 致谢49-50
• 附录 作者简介及攻读硕士学位期间论文发表50

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