漳州水仙开花及花色基因植物表达载体构建与转化研究

发布时间：2017-05-10 08:18

  本文关键词：漳州水仙开花及花色基因植物表达载体构建与转化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)属石蒜科水仙属,属于法国多花水仙的变种,主要生产在上海、浙江、福建等地,其中以漳州水仙最有名,是、一类观赏价值非常高的经济植物。三倍体的中国水仙,难以自然育种或是通过人工杂交产生新的品种。品种单一、繁殖速度有限、病毒积累导致品质下降和品种退化等问题已大大阻碍了中国水仙的发展。因此,开展开中国水仙新品种培育和品种改良的工作意义重大。随着分子生物学的崛起和植物基因工程等技术的发展,为中国水仙新品种的培育提供了新的方法。本研究以漳州水仙为材料,克隆出开花时间调节基因AP1、FT,并构建了植物表达载体pCAMBIA1301-NtFT、 pCAMBIA1301-NtAP1、pC2300-35S-NtFT-OCS 和 pC2300-35S-NtAP1-OCS,以农杆菌为介导转化烟草和漳州水仙,获得了31株的转基因烟草和3株抗性水仙幼苗。同时克隆出花色形成类黄酮代谢途径中关键基因FLS和ANS,构建了植物表达载体pC2300-35S-NtANS-OCS、pBI121-FLS RNAi,并分别注射到水仙花瓣和副冠中进行瞬时表达,观察到水仙花瓣和副冠颜色均发生了变化。研究结果将为开发中国水仙早花新品种和改良花色提供技术基础和理论参考。主要研究内容及结果如下：1、提取漳州水仙花蕾和叶片的RNA,逆转录成cDNA,并以此为模板,根据已发表的水仙的FT、AP1、FLS, ANS基因的全长序列设计特异性引物,利用常规PCR技术分别克隆出中国水仙中控制开花时间的关键基因FT、API和类黄酮途径中关键基因FLS、ANS。分别构建了植物表达载体pCAMBIA1301-NtFT、 pCAMBIA1301-NtAP1、pC2300-35S-NtANS-OCS、pC2300-35S-NtFT-OCS、 pC2300-35S-NtAP1-OCS 和 pBI121-FLSRNAi.农杆菌介导构建好的pC2300-35S-NtFT-OCS 和 pC2300-35S-NtAP1-OCS载体转化到烟草中,pCAMBIA1301-NtFT 和 pCAMBIA1301-NtAPl载体转化到漳州水仙中。2、以农杆菌介导的NtAPl和NtFT载体转化烟草,获得了转基因烟草植株,用PCR 和 Real-time quantitative PCR进行了检测,证明所获得植株为转基因植株。发现转基因烟草植株的花期均比非转基因的要提前10天左右,在表型上发现转基因植株均比非转基因植株瘦弱矮小。3.以农杆菌介导pCAMBIA1301-NtFT和pCAMBIA1301-NtAP1载体转化了漳州水仙,初步获得了3株抗性幼苗。4.首先用GUS基因建立漳州水仙花瓣和副冠中农杆菌介导瞬时表达技术体系,结果表明此方法可以应用在水仙花瓣和副冠中。将构建好的pC2300-35S-NtANS-OCS、pB1121-NtFLSRNAi 和 pSAK277-MdMYB10(本实验室保存)载体以农杆菌介导导入漳州水仙的花瓣和副冠中进行瞬时表达,初步观察到水仙花瓣和副冠中颜色发生了改变。
【关键词】：中国水仙 植物表达载体 RNAi 遗传转化 瞬时表达
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S682.21
【目录】：

• 缩略词10-11
• 摘要11-13
• Abstract13-15
• 第一章 前言15-21
• 1 调控花期基因研究进展15-17
• 1.1 分生组织特异基因API的研究进展16
• 1.2 植物开花基因FT的研究进展16-17
• 2 花卉花色基因工程研究进展17-19
• 2.1 植物类黄酮生物合成及调控研究进展17-18
• 2.2 黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)18
• 2.3 花青素合成酶(anthocyanidin sythase,ANS)18
• 2.4 类黄酮合成相关调控基因18-19
• 3 RNAi技术研究进展19
• 4 水仙遗传转化研究进展19-20
• 4.1 瞬时表达研究进展20
• 5 本研究科学意义20-21
• 第二章 中国水仙NtFT、NtAP1、NtANS植物表达载体的构建21-33
• 1 材料21
• 1.1 载体和菌株21
• 1.2 试剂21
• 2 实验方法21-24
• 2.1 引物的设计和合成21-22
• 2.2 NtAP1、NtFTF和NtANS基因cDNA全长序列的克隆22-23
• 2.3 目的片段的回收23
• 2.4 目的基因连接转化与测序23
• 2.5 质粒提取23
• 2.6 质粒酶切23-24
• 2.7 质粒连接反应24
• 2.8 重组质粒的鉴定24
• 3 NtAP1基因植物表达载体构建路线24-25
• 4 NtFT基因植物表达载体构建路线25
• 5 NtANS基因植物表达载体构建路线25-26
• 6 结果与分析26-32
• 6.1 NtAP1、NtFT和NtANS基因PCR扩增结果26
• 6.2 重组质粒pC2300-35S-NtAPl-OCS构建结果26-27
• 6.3 重组质粒 pCAMBIA1301-35S-NtAPl-OCS 构建结果27-29
• 6.4 重组质粒pC2300-35S-NtFT-OCS构建结果29-30
• 6.5 重组质粒 pCAMBIA1301-35S-NtFT-(9G5 构建结果30-31
• 6.6 重组质粒pC2300-35S-NtANS-OCS构建结果31-32
• 7 讨论32-33
• 第三章 NtFLS RNAi植物表达载体的构建33-43
• 1 试验材料33
• 1.1 植物材料33
• 1.2 主要试剂33
• 2 试验方法33-39
• 2.1 总RNA的提取及cDNA合成35
• 2.2 正反义NtFLS片段的克隆35-36
• 2.3 目的载体转化大肠杆菌及测序36
• 2.4 NtFLSRNAi植物表达载体的构建36-39
• 2.4.1 pKB-NtFLSRNAi双价植物表达载体的构建方法36-38
• 2.4.1.1 pKAN-NtFLS载体构建38
• 2.4.1.2 pKAN-NtFLSRNAi载体构建38
• 2.4.2 pB1121-NtFLSRNAi双价植物表达载体的构建38-39
• 3 结果与分析39-43
• 3.1 NtFLS正义及反义片段的PCR扩增结果39
• 3.2 pKAN-NtFLSRNAi载体的构建结果39
• 3.3 pB1121-NtFLSRNAi表达载体的构建结果39-43
• 第四章 NtAP1、NtFT转化烟草43-58
• 1 试验材料43-44
• 1.1 引物43
• 1.2 主要试剂及仪器43-44
• 1.3 培养基和培养条件44
• 2 试验方法44-46
• 2.1 重组质粒转化根癌农杆菌44
• 2.1.1 含重组质粒的大肠杆菌活化培养及质粒提取44
• 2.2 活化根癌农杆菌及制备感受态细胞44-45
• 2.2.1 根癌农杆菌的活化44-45
• 2.2.2 根癌农杆菌感受态细胞的制备45
• 2.2.3 重组质粒转化根癌农杆菌45
• 2.3 重组质粒转化根癌农杆菌后的鉴定45-46
• 2.3.1 重组质粒酶切鉴定45-46
• 3 烟草遗传转化体系的优化46
• 3.1 最适合诱导芽培养基的确定46
• 3.2 抗生素最适选择压的确定46
• 4 根癌农杆菌介导的NtAP1基因与NtFT基因分别转化烟草46-47
• 4.1 无菌烟草幼苗的培养46-47
• 4.1.1 外植体的预培养46-47
• 4.2 农杆菌侵染液的制备47
• 5 将含有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片步骤47
• 5.1 预培养47
• 5.2 共培养47
• 5.3 脱菌及选择培养47
• 5.4 生根培养47
• 5.5 组培苗的炼苗和移栽47
• 6 转基因烟草植株的PCR检测47-48
• 7 转基因烟草植株主要植物学性状的观测48
• 8 转基因烟草植株RT-PCR检测48
• 9 转基因烟草植株的QPCR检测48-49
• 9.1 转基因烟草植株RNA的提取和逆转录48-49
• 10 结果与分析49-56
• 10.1 转化的农杆菌菌株鉴定结果49-51
• 10.2 烟草遗传转化体系的优化51
• 10.3 烟草转化结果51-52
• 10.4 转基因烟草植株的PCR检测结果52-53
• 10.5 转基因烟草植株RT-PCR检测结果53-54
• 10.6 抗性植株的实时荧光定量PCR检测结果54-55
• 10.6.1 抗性烟草植株的RNA提取结果54-55
• 10.7 转基因烟草植株主要植物学性状的观测结果55-56
• 11 讨论56-58
• 第五章 NtAPl、iWiT转化潭州水仙58-64
• 1 试验材料58-59
• 1.1 植物材料58
• 1.2 根癌农杆菌和质粒58
• 1.3 主要试剂58
• 1.4 培养基和培养条件58-59
• 2 试验方法59
• 2.1 重组质粒转化根癌农杆菌59
• 2.1.1 含重组质粒的大肠杆菌活化培养及质粒提取59
• 2.2 根癌农杆菌的活化及感受态细胞的制备59
• 2.2.1 根癌农杆菌EHA105的活化59
• 2.2.2 根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备59
• 2.2.3 重组质粒转化根癌农杆菌59
• 2.3 重组质粒转化根癌农杆菌后的鉴定59
• 2.3.1 重组质粒酶切鉴定59
• 3 根癌农杆菌介导的重组质粒转化漳州水仙59
• 3.1 漳州水仙花亭的消毒与接种59
• 3.2 农杆菌侵染液的制备59
• 4 转化步骤59-60
• 4.1 预培养59
• 4.2 共培养59-60
• 4.3 延迟筛选培养60
• 4.4 筛选培养60
• 4.5 抗性芽的增殖培养60
• 4.6 生根培养60
• 5 结果与分析60-63
• 5.1 转化的农杆菌菌株鉴定结果60-62
• 5.2 水仙花葶转化结果62-63
• 6 讨论63-64
• 第六章 农杆菌介导的水仙花瓣与副冠瞬时表达64-69
• 1 试验材料64-65
• 1.1 植物材料64
• 1.2 根癌农杆菌和质粒64
• 1.3 主要试剂和仪器64-65
• 2 试验方法65-66
• 2.1 表达载体分别转化根癌农杆菌65
• 2.2 农杆菌渗透液制备65
• 2.3 注射方案65
• 2.4 根癌农杆菌注射法介导的瞬时表达系统的建立65-66
• 3 结果与分析66-67
• 4 讨论67-69
• 参考文献69-76
• 附录：图版和图版说明76-78
• 致谢78

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