猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）噬菌体免疫纳米抗体库构建及抗Cap纳米抗体的筛选

发布时间：2017-09-27 11:34

  本文关键词：猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）噬菌体免疫纳米抗体库构建及抗Cap纳米抗体的筛选

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【摘要】：猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起PCV2相关疾病(PCV2-associated diseases,PCVAD)的主要病原。PCVAD目前呈世界范围内广泛流行,给全世界养猪业造成了重大经济损失。PCV2为单股环状负链DNA病毒,也是目前已知最小动物病毒,Cap蛋白为PCV2唯一结构蛋白,同时也是临床上PCVAD预防和诊断的主要靶标。PCV2的快速检测是预防PCVAD的重要手段之一。为建立快速有效的PCV2血清学检测方法,本研究以商品化PCV2亚单位疫苗为免疫原免疫双峰驼,构建骆驼重链可变区抗体(Single-domain variable heavy chain antibody,VHH or nanobodies)噬菌体免疫库。以原核表达的PCV2 Cap病毒样颗粒(viral like particles,VLPs)为抗原,生物淘洗筛选针对PCV2 Cap的VHHs,为PCV2抗原检测提供高质量抗体。本研究内容分为3部分:1.筛选用抗原制备构建表达Cap蛋白的重组表达质粒pET32a-SUMO-Cap。转入E.coli BL21(DE3),诱导表达并纯化重组Cap蛋白,经SUMO蛋白酶Ulp酶切裂解和Ni2+亲和树脂纯化后获得无任何多余氨基酸的Cap蛋白。进一步经透射电镜观察发现,无多余氨基酸的PCV2Cap蛋白能在体外自组装形成病毒样颗粒(VLPs)。2.构建文库用噬菌粒的改造以商品化噬菌粒pCANTAB5E为载体骨架,通过Linker引入,将pCANTAB5E载体上用于VHH文库插入的Sfi I、Not I双酶切位点变成两个识别序列不同的Sfi I酶切位点。在两个Sfi I酶切位点之间进一步引入CAT/Ccdb正负筛选标签。获得构建VHH文库用噬菌粒pCANTAB5E-Ccdb-cm。克隆效率检测结果发现,改造后的pCANTAB5E-Ccdb-cm噬菌粒与商品化噬菌粒pCANTAB5E相比,显著提高了VHH的克隆效率。3.利用PCV2商品化亚单位疫苗免疫双峰驼,免疫5次后,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录后,两步法扩增获得VHH库。将扩增的VHH库与pCANTAB5E-Ccdb-cm噬菌粒经Sfi I酶切后,连接转化大肠杆菌TG1感受态细胞,成功构建了可用于Cap蛋白VHH淘筛的VHH噬菌体初级库(库容6×106,插入率100%,多样性丰富)。以Cap VLPs为淘筛抗原,通过4轮淘筛和phage-ELISA检测,获得了4株反应性较好的VHHs。本研究构建了PCV2噬菌体免疫纳米抗体库,并筛选到了4株具有抗Cap活性的VHHs,为以VHH抗体为基础的PCV2抗原检测试剂盒研发和PCV2致病机理研究奠定了基础。
【关键词】：猪圆环病毒II型(PCV2) 噬菌体展示抗体库 纳米抗体(VHH) Cap
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文献综述13-27
• 1.1 噬菌体展示技术研究进展13-19
• 1.1.1 丝状噬菌体结构和生活史13-15
• 1.1.2 噬菌体文库的构建15-16
• 1.1.3 淘筛16-17
• 1.1.4 噬菌体展示技术的发展现状17-19
• 1.2 猪圆环病毒2型（PCV2）研究概况19-24
• 1.2.1 PCV2遗传型和抗性19-20
• 1.2.2 易感类群和传播途径20
• 1.2.3 病毒生活史及致病机制20
• 1.2.4 PCVAD20-21
• 1.2.5 PCV2衣壳蛋白Cap21-22
• 1.2.6 目前可以使用的商业化疫苗22-23
• 1.2.7 试验性PCV2疫苗23-24
• 1.2.8 病毒样颗粒（VLP）疫苗24
• 1.3 纳米抗体及其在诊断上的应用24-26
• 1.4 本研究的目的和意义26-27
• 试验研究27-61
• 第二章 噬菌粒载体的改造及Cap的病毒样颗粒的制备27-46
• 2.1 试验材料27-28
• 2.1.1 菌株与质粒27
• 2.1.2 主要试剂及仪器27
• 2.1.3 主要溶液27-28
• 2.1.4 引物设计与合成28
• 2.2 方法28-36
• 2.2.1 pCANTAB5E-linker载体的构建28-30
• 2.2.2 pCANTAB5E-Ccdb-Cm载体的构建30-32
• 2.2.3 pCANTAB5E-Ccdb-Cm和pCANTAB5E-Scfv克隆效率比较32
• 2.2.4 pET32a-SUMO-Cap表达载体的构建32-33
• 2.2.5 重组Cap蛋白的诱导表达33
• 2.2.6 重组Cap蛋白的大量表达与纯化33-34
• 2.2.7 SUMO蛋白酶Ulp的表达与纯化34-35
• 2.2.8 His-SUMO-Cap融合蛋白的酶切与纯化35
• 2.2.9 Cap的病毒样颗粒的鉴定35-36
• 2.3 结果与分析36-44
• 2.3.1 pCANTAB5E-linker载体的构建36-38
• 2.3.2 pCANTAB5E-Ccdb-Cm载体的构建38-39
• 2.3.3 pCANTAB5E-Ccdb-Cm和pCANTAB5E-Scfv克隆效率比较39-41
• 2.3.4 重组Cap蛋白的诱导表达41
• 2.3.5 重组Cap蛋白的纯化与浓缩41-42
• 2.3.6 SUMO蛋白酶Ulp的表达与纯化42-43
• 2.3.7 His-SUMO标签的去除及酶切纯化43
• 2.3.8 Cap蛋白的Western Blotting分析43-44
• 2.3.9 VLPs形成的鉴定44
• 2.4 讨论44-45
• 2.5 小结45-46
• 第三章 噬菌体展示抗体库的构建和特异性抗体的筛选46-61
• 3.1 试验材料46
• 3.1.1 菌株与质粒46
• 3.1.2 试验动物及疫苗46
• 3.1.3 主要试剂46
• 3.1.4 主要仪器设备46
• 3.1.5 主要培养基的配置46
• 3.2 方法46-54
• 3.2.1 动物免疫46-47
• 3.2.2 淋巴细胞的分离47
• 3.2.3 淋巴细胞总RNA的提取47
• 3.2.4 VHH片段的扩增47-48
• 3.2.5 载体和VHH片段的两步酶切48-49
• 3.2.6 VHH抗体库的构建及鉴定49-52
• 3.2.7 特异性抗体的淘选52-53
• 3.2.8 Phage ELISA鉴定抗原阳性重组抗体53-54
• 3.3 结果与分析54-59
• 3.3.1 淋巴细胞分离与RNA提取54-55
• 3.3.2 VHH基因的扩增55
• 3.3.3 载体和VHH片段的两步酶切55-56
• 3.3.4 抗体库的构建和插入率检测56-57
• 3.3.5 抗体库的丰度和多样性鉴定57-58
• 3.3.6 抗体库的淘选58-59
• 3.4 讨论59
• 3.5 小结59-61
• 结论61-62
• 参考文献62-72
• 附录72-76
• 致谢76-77
• 作者简介77

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本文编号：929460