羽毛角蛋白蒸汽闪爆解离与提取研究
第一章 绪论
1.1.1 羽毛资源现状
随着全球工业化的发展和人口的增长，人们对家禽肉类的需求量逐年增多。据美国农业部统计，仅美国商业家禽屠宰总计就将近 90 亿只肉鸡，2.4 亿只火鸡，3 千万只鸭等[1]。家禽的大规模养殖也相应会产生大量废弃物，美国每年因此产生的羽毛约在180 万吨，我国也拥有丰富的羽毛等大宗低值蛋白资源，仅每年产生的羽毛下脚料就将近 70 万吨[2]，但用于服装行业的羽绒制品才 3 万吨左右，饲料行业则不足 10 万吨，大多数被焚烧、掩埋处理[3]。羽毛中的角蛋白含量高达 90%左右，羽毛角蛋白结构复杂，质地坚硬、不溶于水，必须通过物理或化学手段处理提高其生物利用率。若没有合适的加工处理方式，羽毛几乎没有经济价值，而且造成环境污染。
1.1.2 羽毛角蛋白的结构
球状蛋白质一般都是水溶性的，且大多具有一定的生理与营养功能。膜蛋白通常与细胞的各种膜系统结合而存在，不溶于水但能溶于去污剂溶液。纤维状蛋白质通常没有明显的生理活性，主要对生物体起保护、支持和能量储存等作用。它由沿轴向平行排列、相对伸展的多肽链组成，呈长棒状纤维或薄片层形式。纤维状蛋白质通常含有大量重复的二级结构单元，易形成分子排列规则、结构致密的结晶区，这些特点决定了它是一种抗性很强的硬性蛋白，几乎不溶于水，也不被一般蛋白酶水解[4]。角蛋白是一类典型的纤维状蛋白质，广泛分布于生物体的表皮组织中，是毛发、羽毛、羊毛、蹄、角、指甲等的主要组分。根据二级结构相对含量的不同，角蛋白可分为 α 角蛋白和 β 角蛋白。其中，α 角蛋白由“卷曲螺旋”型 α 螺旋构成，以羊毛角蛋白和，毛发角蛋白为代表；β 角蛋白富含甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸等小侧链氨基酸残基，由伸展的反向平行 β 折叠片堆叠而成，以丝素蛋白和羽毛角蛋白为代表[4]。根据二硫键含量的不同，角蛋白又可分为硬角蛋白和软角蛋白。前者因含有大量的二硫键，结构致密，如羊毛、羽毛、指甲等表皮附属物；后者含有较少的二硫键，结构相对松散，多见于皮肤、角质层等[5]。
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由前文分析可知，角蛋白含有大量的二硫键、疏水相互作用、氢键、离子键等化学键，具有折叠紧密的二级结构单元，可形成分子排列规则、结构致密的结晶区，这些特点决定了它是一种抗性很强的硬性蛋白，几乎不溶于水、酸、弱碱等常规试剂，也不被一般蛋白酶水解[4]。因此为了更好地利用角蛋白这一丰富的天然蛋白资源，科技工作者不断努力探索角蛋白的有效解聚方法。
1.2.1 物理法
物理法通常采用机械粉碎、高温、挤压、挤出、微波、超声波法等方法使蛋白质内部的二硫键断裂，破坏其空间结构从而使得角蛋白发生解聚，该放法具有操作简单、污染小等优点，但能耗较高，且产物多为多肽、氨基酸混合物[45]。目前我国仍主要采用传统的高温水解法进行羽毛角蛋白的解聚处理，使其变为蛋白质凝胶，再通过烘干、粉碎处理成为羽毛粉。此方法生产成本相对较低，但反应时间过久造成热敏性氨基酸的损失，而且往往因设备落后，只能使羽毛粉消化率得到有限的改善，并且营养价值差异较大。Hou 等人采用高温高压水解-粉碎技术制备低溶性羊毛粉，发现高温高压水解可显著降低羊毛纤维中 α 螺旋结构以及二硫键的含量[46]。随着膨化技术的兴起，朱选等初步研究了羽毛挤压工艺，发现挤压作用可使得角蛋白在物理形态以及化学结构上均发生根本性变化，从而引起角蛋白的解聚[47]。国外 Barone 等人发现挤压过程中添加亚硫酸钠等还原剂可弱化羽毛角蛋白中二硫键，可进一步提高其挤压膨化过程中的解聚效果[48]。近期研究人员发现，羽毛挤压处理大多需要结合酶解[42]、碱液[49]等复合处理才能达到应有效果。
1.2.2 化学法
化学法通常采用酸、碱或氧化还原剂处理，通过打断二硫键或者肽键的方式，将角蛋白解聚为可溶性蛋白质、多肽或氨基酸。如李闻欣采用超声波辅助酸法制备羊毛角蛋白溶液，有效降低了酸用量，提高了羊毛溶解率[50]。碱处理一般是采用 NaOH 溶液经低温长时[51]或高温短时[52]处理来溶解角蛋白。Coward-Kelly 等人[17]发现 Ca(OH)2溶液则需要更高的处理温度才起作用，150 °C 处理 3 h 可溶解 95%的羽毛角蛋白。酸碱法最大缺点是产生大量碱性废液以及酸蒸汽，污染环境[53]。
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第二章 羽毛蒸汽闪爆工艺研究
近年来，国内外对羽毛粉的研究一直集中于新型加工方法的探索、加工条件对营养价值的影响、营养价值体外评定指标以及羽毛粉替代鱼粉、豆粕等高值饲料的研究等方面[38, 115, 116]。我国在上世纪八十年代开始利用羽毛原料，为规范饲料原料生产、经营和使用，，提高饲料产品质量，保障养殖产品质量安全，农业部最新发布的《饲料原料目录》中将羽毛粉界定为家禽羽毛经水解或膨化后，干燥、粉碎获得的产品，其胃蛋白酶消化率不低于 75%。目前我国仍主要采用传统的加热水解法进行羽毛角蛋白的解聚处理，使其变为蛋白质凝胶，通过烘干粉碎处理成为角蛋白饲料。虽然此方法生产成本较低，但因处于高温时间太久，热敏性氨基酸大量损失，而且仅能有限提升羽毛粉生物效价，并且营养价值波动较大。
在新型加工方法的探索方面，国内外学者开发了许多处理方式来提升羽毛粉生物利用率，一般可分为两大类：热液处理和微生物酶解[117]。热液处理通常采用高温[38]或者高压[118]条件，并添加稀酸[119]或碱液，如氢氧化钠[37]，氢氧化钙[17]，氨水[73]等；微生物酶解法通常筛选能够降解羽毛的微生物来实现，如 Bacillus[84, 85]，Kocuria rosea[86]等。然而，热液处理通常会带来环境污染问题；酶解法中酶的成本相对较高，生产周期也很长，这些都限制了该方法的工业化应用。因此，寻找环境友好、经济可行的羽毛粉生产工艺具有重要的现实意义。本章主要探讨了蒸汽闪爆处理羽毛的可行性，考察了蒸汽闪爆解对羽毛胃蛋白酶消化率以及蛋白质溶解度的影响，并进一步评价了汽爆羽毛粉在鸡、猪、猫和狗等单胃动物中的营养价值。
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2.2.1 实验材料与试剂
鸭毛由杭州启明星生物营养有限公司提供，其蛋白质含量为 90.2%，粗脂肪含量为 1.6%，水分含量为 6.0%；胃蛋白酶（pepsin, P7000），胰蛋白酶 (trypsin)，均购于Sigma-Aldrich 公司；尿素、氢氧化钠、浓盐酸（分析纯）、硼酸、硫酸钾、硫酸铜、亚硫酸钠等，购于国药集团化学试剂有限公司。
2.2.2 实验仪器与设备
蒸汽闪爆机，QBS-200B 型，鹤壁市正道生物能源有限公司；自动消化装置，上海晟声自动化分析仪器有限公司；电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；FE20 台式 pH 计，瑞士 Mettler-Toledo 公司；研磨粉碎机，IKAA11 基本型，德国 IKA 集团；台式高速离心机，CT14D，上海天美生化仪器设备工程有限公司；UV1100 紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；氨基酸分析仪，L-8900，日本日立公司；Agilent 1100 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。
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3.1 引言 ................................................25
3.2 材料与设备............................................25
第四章 羽毛角蛋白蒸汽闪爆解离与降解机制..................38
4.1 引言 ................................................38
4.2 材料与设备............................................38
第五章 羽毛角蛋白的提取工艺研究..........................52
5.1 引言 ...............................................52
5.2 材料与设备..........................................52
第五章 羽毛角蛋白的提取工艺研究
随着资源危机与环境危机的日益凸显，废弃物的资源化、绿色化研究迫在眉睫。相比于传统石油基塑料材料，羽毛、羊毛、胶原蛋白等纤维状蛋白质具有低值、易获取、可再生、可降解、结构可调等优点，这些特点使其能够成为类似于聚酰胺的优良天然生物高分子材料[211]。这些天然蛋白质的资源化利用也因此一直是当前的热点问题。近年来，国内外研究人员正积极开展羽毛材料的加工利用研究，如食品包装[2]、可食性膜[29]、生物吸附剂[36]以及其他复合材料[35]。
与胶原蛋白、肌原纤维蛋白等其他纤维状蛋白质不同，羽毛角蛋白含有大量的分子内/间二硫键交联，这使其很难通过常规试剂溶解或加工处理。研究表明尽管很多方法都能够打开二硫键，如还原法[43, 44]、氧化法[212, 213]或硫解[58]等，但只有少量的试剂（如硫醇、亚硫酸盐等）能够在水解的同时维持蛋白分子结构的完整性。此外，上述方法存在的主要问题是在羽毛、羊毛等纤维状蛋白质的水解/溶解过程中加入了大量的酸、碱、变性剂（尿素、盐酸胍等）、氧化还原剂、表面活性剂或卤化剂等化学试剂，使得角蛋白的提纯需经过透析和冷冻干燥处理，周期长、效率低、成本高、难以工业化生产。近年来，相关报道采用过热水法[78, 80]水解羽毛、羊毛角蛋白，但这会使其结构严重降解成氨基酸或多肽，限制其后续加工利用。
碱提酸沉法被广泛用来提取植物中蛋白质[179, 214]，因为高浓度的碱液能够断开或裂解蛋白分子间羰基和硫酸基团间的氢键[215]，从而引起蛋白质的溶解。鉴于该方法在食品工业中的广泛应用，有必要研究其在羽毛角蛋白提取方面的潜力。尽管前人研究发现羽毛在 1 N NaOH，室温[29]或 0.25 N NaOH，120 °C[52]条件下较易溶解，但如此极端碱处理条件会导致蛋白质肽链的大量降解，不利于维持其蛋白结构的完整性，也不利于角蛋白材料的后续利用。本章主要研究蒸汽闪爆结合碱法提取羽毛角蛋白的可行性，考察了汽爆参数以及不同的碱法提取参数（如料水比、碱液浓度、提取时间、提取温度等）对羽毛溶解率和角蛋白得率的影响，评估了提取的羽毛角蛋白的结构和化学变化，并进一步研究了羽毛角蛋白的功能性质。
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主要结论与展望
1. 蒸汽闪爆对羽毛的物理性状、胃蛋白酶消化率、溶解性能以及胱氨酸等均有显著影响，而对粗蛋白含量，其他氨基酸含量影响不显著。其中，蛋白质溶解度和胃蛋白酶消化率随着汽爆强度的增大而增大，胱氨酸含量随汽爆强度的增大而减小。为防止羽毛粉加工不足与加工过度，确定了合适的胃蛋白酶消化率范围为 75%~85%，溶解度范围为 25%~35%，此时的汽爆压力为 1.4~1.6 MPa，保压时间 1 min。通过比较羽毛粉胃蛋白酶消化率、蛋白质溶解度与有效胱氨酸含量的相互关系，发现可选择操作方便的蛋白质溶解度指标用来指示汽爆羽毛粉是否已加工过度。
2. 扫描电子显微镜结果表明蒸汽闪爆使得羽毛纤维外观结构出现明显破损，规则、紧密的结构逐渐消失；X 射线衍射分析表明羽毛纤维中晶面间距增大，结晶度明显下降；傅立叶变换红外光谱表明羽毛纤维大分子肽段构象由分子间 β 折叠向分子内 β折叠转变，肽链间的氢键缔合作用减弱；热物性分析显示，羽毛角蛋白晶体微观结构遭到破坏，熔融温度降低，使得蛋白质分子内部分亲水基团裸露与水分子形成氢键。
未处理羽毛角蛋白的分子间作用力主要通过氢键与二硫键的交互作用类型存在。随着汽爆处理强度的增大，氢键与二硫键的交互作用效应逐渐变弱，非共价键作用逐渐增强。羽毛角蛋白的添加 β-巯基乙醇前后的尿素溶液以及稀碱液中的溶出行为均表明羽毛角蛋白汽爆处理后发生异质化，并形成了新的共价交联。随着蒸汽闪爆处理强度的增大，二硫键含量显著降低，游离巯基呈先减小后增大的趋势，二硫键的降解与游离巯基的增加不成比例也表明羽毛角蛋白蒸汽闪爆过程中形成了新的化学交联。
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参考文献（略）
本文编号：208569
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/caipu/208569.html
