急性低氧暴露对棕色田鼠脑组织p53基因表达的影响

发布时间：2017-01-05 08:27

1   引言 

1.1   选题背景
地下鼠是一种终生营地下洞道生活的一种啮齿类动物，地下洞道中的环境是一种特殊的低氧环境，若遭遇洪水、暴雨等极端条件，洞道中的氧含量会大幅降低。常年进行地下生活的地下鼠，长期进化产生了一些生物学适应特征，如血氧含量增高[1,2]、红细胞数量增多、肺泡中气体扩散能力增强、血红蛋白含量增高、血液携氧能力增强[3,4]、骨骼肌毛细血管密度增大[5,6]、红细胞体积减小[7-9]等，以应对低氧环境。 研究发现：地下哺乳动物，如鼹形属鼠，Spalax 鼠是一种寿命较长（>20 年）的啮齿类动物，未在行为学、形态学和解剖学方面发现 Spalax 鼠有任何衰老迹象，同样，也未在高龄 Spalax 鼠中发现细菌感染或发炎迹象，即 Spalax 鼠具有抗衰老、长寿的特性。同样，在 40 年研究调查中，从未在刚从外地捕获或饲养在笼子里的 Spalax 鼠个体中发现其患有癌症，以及在 Spalax 鼠个体中，人为注射致肿瘤药物，也并未发现其患有肿瘤，即 Spalax 鼠具有抗癌性，而对 C57BL/6品系的小鼠而言，因疾病死亡的个体中，70%的死于癌症。并且在其它地下鼠，例如裸鼹鼠的研究中，也发现其具有长寿和抗肿瘤的特性[10]。 在 Spalax 鼠抗肿瘤特性中，研究较多的是 p53 的一个抗肿瘤机制。有研究表明，在一定程度的低氧胁迫下，p53 可促进细胞周期停滞，并通过与一个特定的 DNA 结合域结合对受损 DNA 进行修复[10]。另一方面，通过 p53 调节细胞程序性死亡应答低氧胁迫[11]。 环境低氧会对生物机体产生一定的损伤，机体缺氧将导致自身功能障碍，尤其是脑组织的缺氧会对神经细胞产生严重影响，如凋亡（apoptosis）。在低氧应答过程中，低氧诱导因子（hypoxia inducible factor, HIF）作为核心因子，有许多下游调控基因，其通过调节不同的通路对低氧进行应答。p53 是一个重要的肿瘤抑制因子（tumor suppressor gene 53, TP53/ p53），同时也是 HIF 诱导凋亡的一个下游靶基因，长期以来，受到科学家的极大关注。 
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1.2   与低氧诱导因子相关的研究
氧气是维持生命有机体健康生长、繁殖的物质基础，也是生物体进行新陈代谢必不可少的一种非生物因子。当环境中氧气浓度降低时，即造成一种低氧环境。若低氧中的氧气浓度不足以维持生命体的正常活动，低氧可对机体产生一系列生理生化的不良反应。机体中的缺氧情况可以分为三种类型。1）外界环境中氧含量低，机体不能从外界环境中获取足够的氧气，如高原环境；2）外界环境中氧含量充足时，一些疾病所造成的机体自身不能充分地利用氧气，如哮喘；3）机体自身对氧气的消耗量过多，远远超过生物体生理活动所需，如剧烈运动[18]。机体缺氧可导致与复制相关的 DNA 发生损伤，例如增加点突变率、颠换、删除，并降低 DNA 的修复活性[19]。通过低氧暴露处理，肿瘤细胞的低氧微环境可加速肿瘤细胞的生长[20]，同时也可加速非病理细胞的生长[21]。另外，机体缺氧可能会影响内皮细胞增殖——激活紧密耦合的 ATM 和 ATR 激酶的活性，并且可修饰组蛋白 H2AX，H2AX 可促使 DNA 修复的反应[22, 10]。 然而，周围外环境中的低氧环境不一定在第一时间对机体造成损伤，也不一定使机体产生缺氧现象。生物体在长期的进化过程中，在面对应激状态时可以随时做出适应性的反应，这种情况多体现于生物体把能量聚集在脑组织和肌肉中，以此维持生命的正常运转。相反，在低氧环境中，摄食、消化、运动等其它消耗能量的生理活动很可能会威胁机体的安全。因此，在应答低氧时，生物体减少食物的摄取、四肢的运动也成为了一种应激性的表现[23]。低氧是一种可以引起机体产生应激反应的刺激源，当机体处于低氧环境时，低浓度的氧气不能作为机体获取充足能量的一种来源，但是，机体为了应对能量的缺少，就会相应地减少四肢的运动，以此减少能量的过度消耗，保证机体的安全[18]。 机体缺氧可对组织造成一定程度的损伤，如作为重要靶器官的脑组织。机体缺氧也还可对其它器官、系统造成一定程度的伤害，如心血管系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统等[24]。当机体患有缺氧缺血病症时，脑组织海马区、大脑皮层均为缺氧较敏感区域，即易受损脑区[25]。 
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2   急性低氧暴露后复氧对体重变化的影响 

低氧刺激各个脏器和系统，造成组织或细胞的氧供应不足，导致组织的代谢、功能和形态结构发生异常变化，引起机体的应激反应，影响机体的生长发育和生理调节[1]，同时也会对体重产生一定的影响。体重是生物体基础而重要的形态学指标，受到诸多因素（如食物丰富度、食物可利用性、生理状态等）的影响，其中亦包括不良环境压力因素（如急性低氧环境）。个性化（personality）是指动物个体面对同一情景时所表现出的稳定行为差异[2]。动物个性化的研究通常采用镜像图像刺激（mirror-image  stimulation），MIS 是不同种类的动物在面对一面镜子时研究它们的反应，而这种反应代表此动物的社会行为及其侵略行为[3]。 以往的研究表明，低氧暴露对肥胖大鼠的体重产生显著影响，两种不同低氧暴露处理组肥胖大鼠的体重相比对照组显著降低[4]。镜像刺激与动物和同类发生的视觉冲突造成的刺激相类似，但是，二者的方法却不同。视觉冲突是通过其他动物个体与自身不同的视觉效果[5,6]，而镜像刺激则是通过动物自身的镜像。我们通过对实验动物进行镜像刺激分析行为特征，进而区分出不同实验动物的个性化特征[7]。在与另一个动物研究攻击行为，以及直接对抗中，使用MIS的优点在于除了视觉刺激和缺乏物理冲突之外，基本上消除其了它因素[8]。 本研究以棕色田鼠和布氏田鼠为对象，测定并选择个性化得分在0.2-0.6的实验个体，在氧舱内设置急性低氧暴露处理，在不同的复氧时间测定其体重，旨在研究急性低氧暴露后复氧对地下鼠与地面鼠体重变化的影响，以及在低氧暴露后复氧条件下个性化与对体重的关系。 

2.1   材料与方法
实验用健康成年雄性棕色田鼠 12 只，体重在 30-49 g，鼠龄在 3 个月或以上，在实验室内繁殖生长，主要以兔饲料和鼠饲料饲养，并以胡萝卜辅助饲养，提供充足的水源，以锯末作垫料，棉花作巢穴。饲养温度控制在 20-24  ℃，光周期为 14 L:10 D（光照时间为 8:00-22:00）。实验用健康成年雄性布氏田鼠 12 只，体重在 30-49  g,鼠龄在 3 个月或以上,在实验室内繁殖生长，饲养于动物饲养箱内，以锯末作垫料，棉花作巢穴。饲养温度控制在 20-24  ℃，光周期为 14 L:10 D（光照时间为 8:00-22:00）。 
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2.2   结果
12 只雄性棕色田鼠和 12 只雄性布氏田鼠的个性化得分呈正态分布（L. mandarinus  ：0.32 ± 0.16；L. brandtii  ：0.41 ± 0.14）（图 2.1） 去除两侧极端个性化得分的个体，用于实验的个体得分如下（表 2.1）所示。低氧处理组（0.36 ± 0.06）和常氧处理组（0.46 ± 0.04）布氏田鼠的个性化得分差异不显著（t =-1.236, df =10, P =0.245），而棕色田鼠低氧处理组（0.39 ± 0.06）和常氧处理组（0.29 ± 0.03）的个性化得分差异不显著（t =-1.440, df =10, P =0.181）（图 2.2）。急性低氧后复氧时间对棕色田鼠和布氏田鼠的体重影响相似（图 2.4，图
2.5）。急性低氧处理对棕色田鼠和布氏田鼠的体重均呈现抑制作用，随复氧时间增加体重逐渐恢复，至 12-24 h 左右恢复至初始体重水平。 
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3  急性低氧暴露后复氧对 p53 和 HIF-1α 基因表达的影响 ........ 23 
3.1  材料与方法 .... 23 
3.1.1  实验动物 ....... 23 
3.1.2  实验仪器设备及试剂........ 23 
3.1.3  实验方法 ....... 24 
3.1.4  实验数据处理与分析........ 31 
3.2  结果 ...... 31
3.3  讨论 ...... 53 
3.3.1   HIF-1α m RNA 表达量变化 ........ 53 
3.3.2   p53 m RNA 表达量变化 .... 53 
3.3.3   HIF-1α 和 p53 相关性分析 ........ 54 
3.3.4   HIF-1α 和 AI 相关性分析 .......... 54 
4  急性低氧暴露后复氧对海马区 CA1 细胞的影响 ........57 
4.1  材料与方法 .....57 
4.2  结果 ...... 61 
4.2.1  两种鼠不同复氧时间细胞凋亡切片 .... 61 
4.2.2  脑组织海马区凋亡情况 .... 63 
4.2.3  HIF-1α 与细胞凋亡相关性分析........... 65 
4.3  讨论 ...... 67 
5  全文总结 ............ 69 
5.1  主要研究内容与结果 ........ 69 
5.2  主要结论 ........ 70 
5.3  创新点 ............ 71 

4  急性低氧暴露后复氧对海马区 CA1 细胞的影响 

机体缺氧可对组织造成一定程度的损伤，如脑组织，即机体缺氧的重要靶器官。当机体患有缺氧缺血病症时，，脑组织海马区、大脑皮层均为缺氧较敏感区域，即易受损脑区。脑组织对低氧极为敏感，当脑组织受到低氧刺激时，大量的神经细胞会产生生理性病变，如细胞凋亡，以此来躲避低氧对神经的损伤。另外，脑组织作为机体最重要的部分，在面临低氧环境时，机体会对脑组织产生一些低氧补偿机制[1]，避免脑组织在机体遭受低氧胁迫时受到损伤。 以往的研究表明，当一些实体肿瘤细胞遭受低氧的胁迫时，低氧处理后的野生型 p53 的上调，可以导致细胞凋亡[2]。在实体肿瘤细胞中，低氧作为一种选择性胁迫条件，使 p53 发生突变，从而破坏细胞凋亡途径。肿瘤细胞中突变的p53 有可能累积，或是被修复，从而促进细胞增殖或是减少血管细胞的生成。低氧作为一种环境胁迫，可挑选一些特定的 p53 突变体，这些突变体可确保细胞能够抵抗因低氧而诱导的凋亡[3]。在急性极端低氧处理条件下，脑组织海马区的细胞受到一定程度的损伤，一方面可以通过 p53 与受损的 DNA 结合进行修复，另一方面也可以通过 p53 促使受损严重的细胞进行程序性死亡，两种方法都可以有效地避免应激性低氧带来的严重伤害[4]。 迄今为止，大多的研究都停留细胞凋亡过程中的通路及机制，而有关细胞凋亡的诱发机制，如低氧暴露下凋亡途径的分子机制则报道较少。本研究通过低氧暴露后复氧对地下鼠海马区凋亡细胞的影响，揭示低氧对地下鼠和地面鼠细胞凋亡的影响差异。

 

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总结

本论文以毛足田鼠属（Lasiopodomys）的两个物种，棕色田鼠和布氏田鼠为研究对象，采用比较生物学方法，在形态学、组织学和分子生物学三个水平研究了其在低氧暴露下个性化与体重变化的关系、脑组织海马区 CA1 区域细胞凋亡、肿瘤抑制基因 p53 和 HIF-1a 的表达情况，旨在探讨作为地下鼠的棕色田鼠与地面鼠布氏田鼠在肿瘤抑制基因 p53 表达方面的差异，初步揭示了地下鼠抗肿瘤的特性。主要研究内容和结果如下： 
1）成功筛选出具有相近个性化特征的棕色田鼠和布氏田鼠。 基于矿场和镜像刺激实验，利用视频自动分析软件进行实验录像和数据采集，Smarat 3.0 分析实验动物的个性化，然后选择其中个性化得分在 0.2-0.6 的个体，用于后续研究。 
2）低氧暴露下，棕色田鼠和布氏田鼠的体重变化与筛选出的相近个性化得分间相关性不显著（棕色田鼠：r =0.149，P =0.778；布氏田鼠：r =0.064，P =0.905）。说明经过个性化的筛选，成功减少了实验动物个性化对实验结果的影响。 
3）无论是在低氧还是在常氧处理下，棕色田鼠和布氏田鼠的体重变化趋势相似。棕色田鼠低氧组、棕色田鼠常氧组、布氏田鼠低氧组、布氏田鼠常氧组等 4 组动物的体重均呈现先降低后恢复的现象（P =0.015），低氧暴露显著地降低了两种鼠的体重（P =0.038），而鼠种之间（P =0.956）或者鼠种与低氧处理间的交互作用（P =0.394）则均不显著。 
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参考文献(略)

本文编号：234723