呋喃它酮代谢物单链抗体制备和酶联免疫分析方法

发布时间：2024-05-21 03:40

　　从呋喃它酮代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮(5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxazolidinone,AMOZ)衍生物单克隆抗体杂交瘤细胞中克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因,通过(G1y4Ser)3连接肽采用重叠延伸聚合酶链式反应技术构建单链抗体基因,p ET-22b(+)表达载体进行表达,Ni亲和柱进行纯化,制备得到抗AMOZ衍生物单链抗体,采用棋盘滴定实验优化包被原包被浓度和单链抗体稀释度,建立基于此单链抗体的AMOZ残留间接竞争酶联免疫分析方法并对方法进行评价。结果表明:最佳包被抗原质量浓度和单链抗体稀释度分别为0.062 5μg/m L和20倍;建立的间接竞争酶联免疫分析方法半抑制浓度为8.65μg/L,线性范围为2.90～53.28μg/L,检测限为1.48μg/L;除与原药呋喃它酮有交叉反应外,此单链抗体与其他硝基呋喃类抗生素及其代谢物交叉反应率均小于0.1%,虾肉样品添加回收率为74.3%～86.6%;用高效液相色谱-串联质谱法对免疫测定结果进行确证实验,两种方法相关性良好(R2=0.999 2),说明建立的间接竞争酶联免疫分析方...

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

图2抗AMOZ衍生物scFv基因全序列

SOE-PCR扩增电泳鉴定结果和阳性转化子质粒的双酶切鉴定和PCR扩增鉴定结果如图1所示。从图1A可知，SOE-PCR扩增后得到碱基长度约为750bp的scFv基因，与预期片段大小一致。从图1B、C可知，阳性转化子质粒经双酶切和PCR扩增后，都得到了约750bp大小的条带，....

图3重组scFv蛋白SDS-PAGE鉴定（A）和Westernblotting分析（B)

2.2抗AMOZ衍生物scFv表达、纯化和活性鉴定从抗性平板上挑取抗AMOZ衍生物scFv阳性克隆菌的单菌落进行摇瓶培养，以pET22b（+）载体的空菌作为对照，经0.6mol/LIPTG24℃诱导表达7h后收集菌体，进行SDS-PAGE和Westernblot....

图4AMOZ衍生物scFv效价测定和抑制作用分析

从抗性平板上挑取抗AMOZ衍生物scFv阳性克隆菌的单菌落进行摇瓶培养，以pET22b（+）载体的空菌作为对照，经0.6mol/LIPTG24℃诱导表达7h后收集菌体，进行SDS-PAGE和Westernblotting分析，结果见图3。SDS-PAGE结果可知，阳....

图5NPAMOZ的icELISA标准曲线（n=3)

选择2-NBA、3-NBA和4-NBA3种作为衍生剂，由图6A可知，3种硝基苯甲醛衍生剂的衍生效果相差不大，因为绘制标准曲线时用的竞争药物为2-NPAMOZ，所以选择2-NBA作为后续衍生条件优化的衍生剂；加入2-NBA衍生剂25、50、100、200、250μL，考察衍生试剂....

本文编号：3979555