鼠疫耶尔森氏菌外源获得性质粒编码小RNA的筛

发布时间：2017-03-16 19:00

  本文关键词：鼠疫耶尔森氏菌外源获得性质粒编码小RNA的筛选、鉴定与功能的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景鼠疫是一种自然疫源性疾病,其病原菌是鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)鼠疫菌共含有3个质粒,即pCD1、pMT1和pPCP1,pCD1质粒为鼠疫菌和假结核耶尔森氏菌所共有,pMT1与pPCP1质粒则是鼠疫菌在进化过程中外源性获得的,为鼠疫菌所特有,与鼠疫菌的致病性密切相关。细菌中除了蛋白类的调控因子之外,还存在许多发挥调控作用的非编码RNA(non-coding RNA),在细菌中也称作小RNA(small RNA,小 RNA)。小RNA作为调节子,可参与细菌内铁代谢、糖代谢、群体感应、外膜蛋白合成、毒力等生理功能的调控,对原核生物生理和毒力发挥着重要的调节作用。本研究利用高通量测序技术对在不同条件下生长的鼠疫菌提取它的总RNA进行转录组测序,新发现了104个小RNA,其中包括pMT1与pPCP1质粒上的多个小RNA,而这两个质粒又是鼠疫菌在进化过程中获得的,因此验证pMT1与pPCP1质粒上小RNA的功能是鼠疫菌致病机制研究的重要组成部分。本研究旨在利用Northern blot验证新发现的小RNA,并构建小RNA的基因缺失株,通过一系列的表型筛选实验,初步探究了小RNA对鼠疫菌生存能力和致病能力的影响。结果与讨论：(1) 利用Northern blot实验方法共确定了10个小RNA的存在,分别为sRl8、sR3425、sR3457、sR3461、sR3446、sR3411、sR4338、sR4340、sR6142和sR6143,又对本次确定的小RNA和前期验证的部分小RNA做了大小和Hfq依赖性的验证。验证大小的小RNA有sR16、sR271、sR82、sR138、sR524、sR503、sR3446、sR3457、sR3461、sR4338、sR4340、sR6142、sR6143、sR18和sR3411共15个,这些小RNA的大小基本和预测结果一致。sR16、sR4338、sR82、sR138和sR510在野生株的表达量高于Hfq突变株,因此这些小RNA的稳定表达依赖于Hfq蛋白,sR271、sR363、sR524、sR3461、sR18和sR3411在野生株中和Hfq突变株中的表达量几乎一样,且sR503和sR147在野生株中的表达量低于突变株,这些小RNA的稳定表达不依赖于Hfq蛋白。(2)采用基于λRed重组系统的基因突变技术,共成功构建了16株小RNA缺失株分别是ΔsR4338、ΔsR4339、ΔsR4340、ΔsR3457、ΔsR3446、ΔsR6143、ΔsR378、ΔsR3383、ΔsR3440、ΔsR18、ΔsR6094、ΔsR3411、ΔsR6106、ΔsR6097、ΔsR3425和ΔsR3438。同时在缺失株的基础上成功构建了一株过表达株,即pBAD-sR3383。(3)利用表型和毒力实验,验证这些小RNA对鼠疫菌的生理和毒力的调控关系。在生物膜形成方而,sR3446缺失后,鼠疫菌的菌落表而比野生株光滑,因此sR3446可能正调控鼠疫菌生物膜的形成。当sR3425、sR3383、sR3457和sR6143缺失后,鼠疫菌菌落表而变得更加粗糙,因此这几个小RNA可能负调控鼠疫菌生物膜的形成。基于此我们又进行了结晶紫实验,对生物膜形成情况做定量分析,结果显示sR3446、sR3425、sR3383、sR3457和sR6143对鼠疫菌生物膜形成的调控与菌落表面褶皱实验结果基本一致。我们通过在正常条件、高盐条件和酸性条件下培养鼠疫菌野生株和小RNA突变株分析不同菌株在胁迫条件下生长速率的变化,从而验证小RNA对鼠疫菌生存能力的影响,结果显示只有ΔsR3425缺失株在这三种条件下的生长速率均低于野生株,因此sR3425能够增强鼠疫菌应对外界环境变化的能力。我们通过小鼠攻毒实验验证了小RNA对鼠疫菌毒力的影响,利用软件GraphPad Prism 5对实验结果进行分析并计算鼠疫菌野生株和小RNA突变株生存曲线差异的P值,当P值≤0.05时认为两者的差异有统计学意义,结果显示：ΔsR3440、ΔsR3383、ΔsR378、Δ sR6094、4 sR3411、Δ sR4339和ΔsR6097的P值分别为0.0258、0.0075、0.0004、0.0003、0.0267、0.0156和0.0143,因此我们认为这些小RNA能够影响鼠疫菌的毒力。
【关键词】：鼠疫菌 小RNA 生物膜 毒力
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 本文研究中所用缩略词8-12
• 前言12-20
• 1. 鼠疫菌的危害12
• 2. 鼠疫菌的生化特征和致病机理12-13
• 3. 鼠疫菌和假结核菌的比较13
• 4. 细菌小RNA的研究13-17
• 4.1 细菌小RNA的概念和特征13-14
• 4.2 细菌小RNA的分类14-15
• 4.3 小RNA与其伴侣分子Hfq15
• 4.4 细菌小RNA的功能15-17
• 5. 鼠疫菌小RNA的研究17-18
• 6. 研究目的与意义18-19
• 7. 技术路线19-20
• 第一章 小RNA的鉴定20-38
• 1. 引言20-21
• 2. 实验材料21-24
• 2.1 菌株21
• 2.2 实验所用试剂21-22
• 2.3 实验仪器22-23
• 2.4 溶液配制23-24
• 3. 实验方法24-33
• 3.1 鼠疫菌的培养24-25
• 3.2 总RNA的提取25-27
• 3.3 体外转录制备小RNA探针27-30
• 3.4 Northern Blot实验验证30-33
• 4. 结果与分析33-38
• 4.1 PCR扩增线性DNA模板33-34
• 4.2 地高辛标记的RNA探针的制备34-35
• 4.3 总RNA质量检测35
• 4.4 Northern Blot验证小RNA35-37
• 4.5 讨论37-38
• 第二章 鼠疫菌小RNA突变株的构建38-52
• 1. 引言38-40
• 2. 实验材料40
• 2.1 菌株和质粒40
• 2.2 主要试剂40
• 2.3 主要仪器与试剂配制40
• 3. 实验方法40-49
• 3.1 小RNA突变株的构建40-45
• 3.2 小RNA过表达株的构建45-49
• 4. 结果与分析49-52
• 4.1 小RNA缺失株的构建49-51
• 4.2 小RNA过表达株的构建51
• 4.3 讨论51-52
• 第三章 小RNA生理和毒力的研究52-68
• 1. 引言52
• 2 实验材料52-56
• 2.1 菌株52-53
• 2.2 实验动物53
• 2.3 主要试剂53-54
• 2.4 主要仪器54
• 2.5 溶液和培养基的配制54-56
• 3. 实验方法56-58
• 3.1 鼠疫菌小RNA对生物膜形成的影响56-57
• 3.2 鼠疫菌小RNA对其生长的影响57
• 3.3 鼠疫菌小RNA对高盐环境耐受的影响57
• 3.4 鼠疫菌小RNA对酸性环境耐受的影响57-58
• 3.5 小鼠存活实验58
• 4. 结果与分析58-68
• 4.1 小RNA对鼠疫菌生物膜形成的影响58-61
• 4.2 小RNA对鼠疫菌在不同生长条件下的影响61-65
• 4.3 小RNA对鼠疫菌毒力的影响65-66
• 4.4 讨论66-68
• 参考文献68-76
• 附录76-88
• 致谢88-89
• 硕士期间发表的论文89

【参考文献】

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1 刘福芮;钟志军;周紫\

本文编号：252156