MiR-124在非洲爪蟾视网膜细胞分化中的作用和机制

发布时间：2017-03-18 16:06

  本文关键词：MiR-124在非洲爪蟾视网膜细胞分化中的作用和机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景：神经细胞的发生和分化机制是神经发育生物学的基本科学问题,也是揭示相关神经和精神疾病机理的基础。神经细胞的产生是建造神经系统的第一步。神经元一旦产生就不能再被取代。这意味着,一个细胞是否将变成神经元,并成为神经元的哪一部分的哪一类神经元,在发育早期就已经决定并且是不可改变的。这个决定过程依赖于基因,是通过基因的表达这一选择过程完成的。体内每一个细胞都携带着相同的DNA,神经元前体中的基因表达是如何进行选择而产生不同的神经元的呢?。近年诱导多能干细胞技术的发展为干细胞在神经结构和功能损伤修复中的利用带来希望,但已有的研究结果显示多能干细胞在体内发育的命运具有时空依赖性而其机制尚未完全明了,如何在体内控制干细胞的定向分化仍是尚待解决的问题MiRNA是一类内生由蛋白质编码基因或者非编码基因的内含子转录加工而来的约22个核苷酸分子的非编码RNA小分子,通过降解目标基因或与目标mRNA的3’非编码区序列互补抑制其转录过程,造成基因的表达量下降,参与调节动物的发育。已知的哺乳动物miRNA中约有50%在成体大脑和发育中的神经系统存在,参与对胚胎和成体神经干细胞发育和分化多个阶段的调控。对miRNA在神经细胞发生中作用的分析将有助于全面解析神经发育的分子调控网络,也将为miRNA在相关神经疾病治疗中的应用提供重要的线索。MiRNA表达具有时间、组织表达特异性。一个miRNA可以调控多个靶基因,一个基因也可能受到多个miRNA的调节。所以,niRNA功能和复杂调控网络的分析仍是目前的挑战性问题。MiR-124(过去有miR-124a, miR-124b等分类,现统称为miR-124)是一个特异性表达在神经系统的miRNA,在大脑和眼睛的发育过程中都发挥着重要的作用。我们之前的文章报道过,miR-124能够调节早期神经发生,爪蟾体内若缺乏miR-124会导致视神经和视杯的畸形。然而,miR-124是否参与视网膜细胞命运的特化过程以及其中潜在的分子机制在很大程度上都是未知的,仍待探究。研究结果：我们通过实验发现miR-124能够影响视网膜双极细胞和水平细胞的细胞命运,而不影响其它细胞在视网膜的命运。MiR-124在视网膜过表达会导致视网膜双极细胞比例降低、水平细胞比例升高。免疫组化结果证明,miR-124过表达导致OTX2特异性标记的双极细胞比例减少,而抑制miR-124表达会导致视网膜双极细胞比例升高,。这说明miR-124在双极细胞的细胞命运特化过程中发挥重要作用。通过进一步实验发现Otx2参与了miR-124对视网膜细胞命运的调控过程。通过生物信息学分析结果发现miR-124与Otx2 mRNA的3’端非编码序列是互补的,且这种互补在多种脊椎动物物种之间都是相当保守的。我们进一步通过体外荧光素酶实验证明miR-124可通过作用于Otx2 mRNA的3’端非编码序列抑制蛋白的表达量。而且Otx2mRNA能够挽回miR-124过表达造成的视网膜细胞命运改变的效应。从分子水平上和组织水平上都证明了OTX2可能参与了miR-124对视网膜双极细胞和水平细胞细胞命运的调控。研究结论：miR-124过表达影响视网膜双极、水平细胞的命运；并可通过调控Otx2表达调节爪蟾视网膜双极细胞的发生。本研究结果不仅有助于解析神经发育分子调控网络,也为利用miRNA进行细胞的定向诱导分化和相关神经疾病研究提供了新的线索。
【关键词】：细胞命运特化 视网膜 microRNA miR-124 Otx2基因 爪蟾 发育 神经系统 双极细胞
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R338.3
【目录】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 英文缩略词9-10
• 文献综述10-23
• 1 脊椎动物胚胎发育10-15
• 1.1 脊椎动物发育模式10
• 1.2 神经系统发育10-12
• 1.3 神经管的初始分化12-13
• 1.4 眼睛的早期发育13
• 1.5 视网膜的神经发生13-15
• 2 脊椎动物早期发育的遗传调控15-18
• 2.1 同源异型盒基因15-16
• 2.2 转录因子16
• 2.3 Otx2基因16-18
• 3 MicroRNA18-22
• 3.1 MicroRNA简介18-19
• 3.2 MiRNA发展简史19
• 3.3 MiRNA的生物合成和作用机制19-20
• 3.4 MiRNA的研究现状20-21
• 3.5 MiR-124与神经系统21-22
• 4 实验动物爪蟾22-23
• 前言23-28
• 实验设计26-27
• 实验技术路线27-28
• 材料和方法28-35
• 实验方法28-34
• 1. 实验动物及其胚胎的获取和处理28
• 2. 脂质体转染28-29
• 3. 冰冻切片29
• 4. 免疫组化29-30
• 5. PCR扩增30
• 6. PCR产物纯化30-31
• 7. DNA酶切31
• 8. 质粒链接31
• 9. 转化感受态细胞31
• 10. 质粒扩增31
• 11. 挑取菌落培养31-32
• 12. 细胞复苏32
• 13. 细胞传代32
• 14. 细胞质粒转染32-33
• 15. 细胞裂解33
• 16. 荧光值测定33
• 17. 统计学处理33-34
• 实验材料34-35
• 1. 实验仪器34
• 2. 实验材料34-35
• 结果35-53
• 第一部分：MiR-124影响爪蟾视网膜细胞命运决定35-41
• 1.1 pCS2-gfp-miR124质粒有效性验证35-39
• 1.2 MiR-124过表达抑制爪蟾视网膜双极细胞生成,促进水平细胞增加39-41
• 第二部分：MiR-124可直接作用于Otx23’UTR41-46
• 2.1 不同物种miR-124、Otx23'UTR序列比对同源性高41-43
• 2.2 荧光素酶试验测定miR-124直接作用Otx2靶序列抑制蛋白表达43-46
• 第三部分：MiR-124通过调节Otx2表达控制双极细胞命运46-53
• 3.1 MiR-124过表达抑制视网膜OTX2阳性双极细胞生成46-47
• 3.2 MiR-124表达下调促进视网膜双极细胞增加47-49
• 3.3 0 tx2 mRNA过表达促进视网膜双极生成49-50
• 3.4 0 tx2 mRNA与miR-124过表达质粒共转染能够挽回miR-124过表达造成的细胞命运改变50-53
• 讨论53-54
• 参考文献54-61
• 致谢61-62
• 个人简历62

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