旋毛虫谷胱甘肽S-转移酶的克隆表达及鉴定

发布时间：2017-03-22 08:12

  本文关键词：旋毛虫谷胱甘肽S-转移酶的克隆表达及鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione-S-transferase,GST)是一种具有解毒功能的酶,对各种有害的外源性化合物(如致癌物质和诱变剂)与细胞内源性化合物(如脂质过氧化合物)均有分解功能。GST在寄生虫的抗氧化系统中发挥着重要的作用,它可以除去大部分的外源性和内源性的亲电子化合物,有助于寄生虫在宿主内的生存。GST蛋白酶在一些寄生虫中已被鉴定并有所研究,如犬恶丝虫、马来丝虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、肝片吸虫及猪带绦虫等,但关于旋毛虫GST的研究目前尚未见报道。本研究利用生物信息学分析了Ts GST与其它寄生虫及模式生物GST的进化关系,应用分子克隆基因技术表达并纯化了一种旋毛虫谷胱甘肽转移酶Ts GST,获得r Ts GST蛋白及其免疫血清。通过SDS-PAGE和Western blot分析了该重组蛋白的抗原性及免疫原性,RT-PCR、Western blot及免疫荧光试验(IFA)鉴定了Ts GST基因在旋毛虫不同发育虫期的转录、表达及其在虫体的定位;观察了r Ts GST免疫小鼠后的抗体应答类型及对宿主的免疫保护作用、免疫血清对旋毛虫侵入肠上皮细胞(IEC)的影响及免疫血清介导的巨噬细胞对旋毛虫的杀伤作用(ADCC)。运用生物化学方法分析了r Ts GST的酶活性及其最佳反应条件。本研究鉴定了r Ts GST的性质及其功能,为阐明旋毛虫的侵入、生存及其与宿主小肠上皮细胞的相互作用和致病机制奠定基础。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物及细胞系旋毛虫(Trichinella spiralis)由郑州大学基础医学院寄生虫教研室昆明小鼠传代保种。BALB/c小鼠、4-6周龄,购自河南省实验动物中心。所用细胞系为小鼠肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC),是由本教研室分离培养。2.r Ts GST的免疫学分析将r Ts GST免疫BALB/c小鼠,获得r Ts GST免疫血清,应用旋毛虫感染小鼠血清及r Ts GST通过ELISA及Western blot鉴定r Ts GST的抗原性。3.Ts GST基因的转录、表达及定位收集旋毛虫的感染性幼虫、成虫、新生幼虫及肌幼虫,提取总RNA进行RT-PCR,扩增Ts GST基因及内参基因GAPDH,检测Ts GST基因的表达时相。收集小鼠感染旋毛虫后3d与7d的成虫,新生幼虫及肌幼虫,制备可溶性抗原进行Western blot,用r Ts GST免疫血清对不同虫期的可溶性抗原进行识别,检测Ts GST蛋白在不同虫期是否有表达。收集旋毛虫感染性幼虫、3d与7d成虫、新生幼虫及肌幼虫,IFA检测r Ts GST免疫血清与旋毛虫不同发育时期虫体的反应性,观察Ts GST蛋白在虫体的定位。将收集的不同期虫体进行石蜡包埋组织切片,通过IFA观察Ts GST蛋白在不同时期虫体的具体定位。4.r Ts GST蛋白的免疫保护性分析将60只BALB/c小鼠随机分为3组(每组20只):分别为r Ts GST蛋白免疫组、佐剂及PBS对照组。按20μg蛋白/只小鼠的剂量进行皮下多点注射,每隔10 d免疫1次,共3次,末次免疫后10 d,每只小鼠经口攻击感染300条旋毛虫肌幼虫。攻击感染后7d每组各剖杀10只小鼠,回收肠道期成虫并计算成虫减虫率,剩余小鼠感染后42 d剖杀,收集肌幼虫并计算肌幼虫减虫率。同时收集小鼠免疫后不同时间血清,利用ELISA分析r Ts GST蛋白免疫小鼠所引起的免疫反应类型。5.r Ts GST免疫血清对旋毛虫侵入IEC的影响及ADCC作用为了观察r Ts GST免疫血清体外对旋毛虫侵入IEC的影响,将r Ts GST免疫血清、感染后42 d小鼠血清及正常小鼠血清分别与半固体培养基按1:10混合,加入感染性幼虫,覆盖到IEC细胞表面,37℃、5%CO2条件下培养2 h,观察幼虫侵入IEC细胞的情况,计算侵入率。将旋毛虫肌幼虫与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养,并加入不同浓度的重组蛋白免疫血清(1:5、1:50、1:100、1:200及1:500),37℃、5%CO2条件下培养至30h,观察肌幼虫存活的情况,计算死亡率,观察r Ts GST免疫血清介导的抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。6.Ts GST与寄生虫及模式生物GST的进化关系分析在Gen Bank搜索并保存其它生物GST的氨基酸序列,利用MEGA6.0软件构建进化树,构建进化树遵从最佳简约原则,根据进化树分析Ts GST与其他物种的进化关系。选取旋毛虫属中的本土旋毛虫(T.nativa)和伪旋毛虫(T.pseudospiralis)以及血吸虫属中的曼氏血吸虫和日本血吸虫的GST氨基酸序列,利用Clustal W软件对氨基酸序列进行氨基酸序列的相似性分析。7.r Ts GST的酶活性及其性质分析GST具有催化还原性谷胱甘肽GSH与2,4二硝基苯CDNB结合的能力,其结合产物的光吸收峰值波长为340nm,通过测定340nm处吸光度上升速率,计算出GST的酶活力。r Ts GST酶在不同温度和不同p H值的反应条件下,观察该酶反应的最佳温度和p H值,以及金属离子与其他试剂对酶活性的影响。结果1.ELISA结果显示,r Ts GST免疫血清与旋毛虫可溶抗原产生阳性反应;Western blot发现,抗r Ts GST血清可识别旋毛虫可溶性抗原及纯化的r Ts GST,均在24 k Da处显示明显条带,表明r Ts GST具有较强的抗原性,且Ts GST是旋毛虫可溶性抗原的组分。2.RT-PCR分析结果表明,Ts GST基因在旋毛虫感染性幼虫、成虫、新生幼虫和肌幼虫4个时期均有表达;Western blot显示Ts GST蛋白在旋毛虫各个虫期都有表达。IFA结果显示,r Ts GST免疫血清能够与旋毛虫不同发育时期的虫体发生阳性反应(显现黄绿色荧光);虫体组织切片IFA结果显示Ts GST主要位于虫体的皮层、杆状体和生殖原基部位。3.r Ts GST蛋白免疫小鼠后可以产生抗Ts GST的高滴度抗体,诱导产生了以Th2免疫反应为主的免疫反应(表现为高水平的Ig G1)。旋毛虫攻击感染后,r Ts GST免疫小鼠的成虫和肌幼虫减虫率分别为35.71%和38.55%。4.r Ts GST免疫血清体外对旋毛虫侵入IEC具有明显的抑制作用,r Ts GST免疫血清、感染血清及正常血清3组的幼虫侵入率分别31.0%,11.36%及78.96%(χ2=46.4,P0.05)。ADCC实验结果显示,免疫血清组的虫体死亡率70%,明显高于正常血清组的12%(χ2=69.048,P0.001),虫体死亡率具有抗体剂量依赖性(χ2=173.332,P0.001)。5.进化树分析发现,Ts GST与旋毛虫属中的本土旋毛虫和伪旋毛虫GST的进化最近,与人类GST的进化关系最远。氨基酸序列相似性比对结果显示,Ts GST氨基酸序列与本土旋毛虫、伪旋毛虫、曼氏血吸虫及日本血吸虫的GST氨基酸序列的相似度分别为60%、65%、31%、30%。6.r Ts GST生化性质分析结果显示,纯化后的r Ts GST蛋白具有GST酶活性,最适反应条件是温度为40℃,p H 6.3 7.2。H2O2可完全抑制酶的活性,Mn2+和Na+离子可部分抑制酶的活性,Ca2+、Mg2+和K+离子对GST酶活性无明显影响,但Ni2+离子可将酶活性增加54.7%。结论1.重组的Ts GST蛋白具有良好的抗原性及GST的酶活性;2.Ts GST在旋毛虫不同发育期均有转录与表达,主要定位在虫体的皮层、杆状体和生殖原基;3.r Ts GST免疫血清在体外对旋毛虫侵入IEC具有明显的抑制作用,通过ADCC作用对肌幼虫具有明显的杀伤作用,表明GST是旋毛虫幼虫的侵入相关蛋白。
【关键词】：旋毛虫 谷胱甘肽转移酶(GST) 侵入 肠上皮细胞 免疫保护
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;R383.15
【目录】：

• 摘要5-9
• Abstract9-17
• 英文缩略词17-19
• 1 前言19-22
• 1.1 旋毛虫感染引起的免疫应答19
• 1.2 谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione transferase，GST）的功能19-20
• 1.3 GST在寄生虫感染中作用的研究20
• 1.4 研究的内容、目的和意义20-22
• 2 材料22-29
• 2.1 主要试剂22
• 2.2 主要仪器22-23
• 2.3 主要试剂的配制23-29
• 3 方法29-48
• 3.1 技术路线29
• 3.2 实验动物、旋毛虫虫种及细胞系29-30
• 3.3 旋毛虫各个虫期的收集30
• 3.4 旋毛虫肌幼虫ES抗原与各个虫期可溶性抗原的制备30-31
• 3.5 总RNA的提取31
• 3.6 cDNA反转录步骤31
• 3.7 引物设计31-32
• 3.8 目的基因PCR扩增32
• 3.9 重组基因克隆载体的构建与鉴定32-36
• 3.10 rTsGST的诱导表达36
• 3.11 rTsGST的SDS-PAGE分析36-37
• 3.12 rTsGST的可溶性分析37
• 3.13 rTsGST的纯化37-38
• 3.14 rTsGST免疫血清的制备38
• 3.15 rTsGST的ELISA鉴定38-39
• 3.16 rTsGST的Western blot鉴定39-40
• 3.17 TsGST基因的转录与蛋白的表达鉴定40-41
• 3.18 TsGST蛋白在虫体的具体定位41-43
• 3.19 旋毛虫rTsGST蛋白小鼠体内实验43-44
• 3.20 rTsGST免疫血清对旋毛虫影响的体外实验44-45
• 3.21 TsGST与其他寄生虫和模式生物的进化关系45-46
• 3.22 rTsGST酶性质的鉴定46-47
• 3.23 统计学处理47-48
• 4 结果48-70
• 4.1 TsGST生物信息学分析48-50
• 4.2 引物设计50-51
• 4.3 旋毛虫总RNA的提取51
• 4.4 TsGST基因的PCR扩增51-52
• 4.5 TsGST重组质粒的构建52-55
• 4.6 rTsGST蛋白的SDS-PAGE分析55-57
• 4.7 rTsGST在肌幼虫ES和可溶抗原的免疫学分析57-59
• 4.8 TsGST基因的转录水平及翻译水平鉴定59-60
• 4.9 rTsGST在裸虫虫体的表达及在组织中具体的定位60-61
• 4.10 rTsGST蛋白体内实验结果61-64
• 4.11 rTsGST免疫血清对旋毛虫影响的体外实验64-65
• 4.12 rTsGST进化树和序列比对分析65-67
• 4.13 rTsGST的生化性质分析67-70
• 5 讨论70-73
• 5.1 谷胱甘肽S-转移酶（GST）研究70
• 5.2 TsGST的生物信息学分析70
• 5.3 rTsGST的免疫原性和抗原性的鉴定70-71
• 5.4 rTsGST的体内体外实验71-73
• 6 结论73-74
• 参考文献74-78
• 综述 旋毛虫感染引起的免疫应答及谷胱甘肽S-转移酶的研究78-90
• 参考文献86-90
• 个人简历及硕士在读期间发表的论文90-91
• 致谢91

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 薛里;王爱德;;一种大量收集旋毛虫新生幼虫的简便方法[J];中国寄生虫病防治杂志;1993年01期

2 崔晶,王中全,张灯;旋毛虫肌幼虫排泄分泌物中特异性诊断抗原的研究[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2003年05期

  本文关键词：旋毛虫谷胱甘肽S-转移酶的克隆表达及鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：261165