衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1的分段克隆表达及其与沙眼衣原体相互作用的功能区域初探

发布时间：2017-03-27 15:15

  本文关键词：衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1的分段克隆表达及其与沙眼衣原体相互作用的功能区域初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)是一种较常见性传播疾病(Sexually transmitted disease,STD)病原体。沙眼衣原体感染后,患者会出现一系列的临床症状,例如宫颈炎、阴道炎、子宫内膜炎、盆腔炎、非淋菌性尿道炎、前列腺炎、Reiter综合征、性病性淋巴肉芽肿等[1,2]。若感染沙眼衣原体后不积极治疗,则可能导致女性患者出现自然流产、胎膜早破、异位妊娠、早产和输卵管性不孕等严重并发症的发生。而且长期、反复的沙眼衣原体感染可能增加女性患者宫颈鳞状上皮细胞癌、艾滋病感染的危险性[3]。2001年,据世界卫生组织(WHO)报道,世界上每年有新增沙眼衣原体感染病例约9200万例,其中有70%女性患者及50%男性患者为无症状感染者,而实际的感染者远远超出此统计数字[4]。美国疾病控制与预防中心(CDC)的统计数据显示:从2007年-2012年,在青中年人群中沙眼衣原体的感染率达到1.7%[5]。沙眼衣原体感染已经成为美国最为常见的性传播疾病,发病率较高,每年新增感染者大于140万[6]。并且,女性患者发病率高于男性患者[7]。泌尿生殖道沙眼衣原体感染已经成为最常见的性传播疾病之一。泌尿生殖道沙眼衣原体感染严重的危害了人类的健康,如何更好的治疗该疾病,已经成为了较为重要的公共卫生问题。近些年来,由于抗生素的滥用,耐药菌感染率不断增加,使抗生素在细菌感染性疾病中的应用遇到了瓶颈。临床中,衣原体的治疗也遇到了同样的难题。而衣原体噬菌体对衣原体的天然杀伤作用为衣原体感染性疾病的控制及治疗提供了良好的发展前景,可以利用衣原体噬菌体作为一种生物制剂来治疗沙眼衣原体的感染。但在此之前,我们需要进一步的确定衣原体噬菌体与衣原体的相互作用区域,以便更好的了解两者间的相互作用机制。衣原体噬菌体具有三种主要结构蛋白,包括Vp1,Vp2和Vp3。Vp1是主要的并且是最大的衣原体噬菌体衣壳蛋白,一些研究显示Vp1可能是衣原体噬菌体识别粘附宿主的功能区域[8,9]。对Vp1氨基酸序列的分析显示在其氨基酸序列216-299和462-467间存在两个明显的不同区域[8]。其中较大的被称为IN5环,研究者预测它暴露在病毒表面并在其表面形成蕈样突起。较小的区域被称为INS,也考虑是暴露在病毒表面,而且预测其与IN5环位置极为贴近并相互作用[9]。在衣原体噬菌体Vp1序列的差异主要是指区域:IN5和INS。这表明IN5和INS区域参与受体的识别。硅片分析证实两个区域彼此相邻,这表明它们在决定不同衣原体噬菌体的宿主范围和组织嗜性中起主要作用[10]。相关研究发现衣壳蛋白Vp1对沙眼衣原体具有抑制其生长的作用[11],而且作用效果显著。本研究通过进一步缩小衣原体衣壳蛋白Vp1的表达片段,来寻找衣原体噬菌体与衣原体相互作用的功能区域。[目的]将衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1分段克隆表达,初步确定衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1与沙眼衣原体相互作用的功能区域。[方法]通过I-TASSER、PredictProtien等蛋白质空间结构分析网站对衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1的空间结构及其与沙眼衣原体相互作用的功能位点进行预测分析,根据预测结果以及研究背景,将衣壳蛋白Vp1分为不同的部分进行表达,通过TA克隆技术克隆表达目的蛋白,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot免疫印迹技术对目的蛋白进行鉴定,再通过氯化钾胶回收法对目的蛋白进行纯化,并进行蛋白定量。将目的蛋白分别作用于沙眼衣原体E型标准株,观察并分析衣壳蛋白Vp1全长及两个蛋白片段分别对沙眼衣原体E型标准株的抑制作用,并进行比较分析。[结果]根据预测结果及相关背景资料将衣壳蛋白Vp1分为Vp11-189和Vp1190-502两部分,目的蛋白Vp11-189和Vp1190-502的基因序列长度分别为567bp和939bp,通过SDS-PAGE以及Western-blot鉴定结果显示蛋白Vp11-189和Vp1190-502的相对分子质量分别为20KD和35KD,并且获得了纯化的蛋白Vp11-189和Vp1190-502。同时,体外干预实验结果显示蛋白Vp11-189、Vp1190-502及Vp1对沙眼衣原体均有抑制作用,且抑制率分别为43.95%、81.74%和78.02%。[结论]成功将phiCPG1衣壳蛋白Vp1分为Vp11-189、Vp1190-502两部分进行表达,通过体外干预实验证明,蛋白Vp1190-502与衣壳蛋白Vp1对沙眼衣原体E型标准株具有相似的抑制作用,并且作用效果显著。蛋白Vp1的190-502氨基酸片段对沙眼衣原体生长有更为明显的抑制作用,这为后期的深入研究提供了一定的参考价值。
【关键词】：衣原体噬菌体 phiCPG1 Vp1 蛋白 功能区域
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R374.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 符号说明11-13
• 前言13-18
• 研究现状、成果13-16
• 研究目的、方法16-18
• 一、衣壳蛋白Vp1空间结构预测及其分段克隆表达、鉴定及纯化18-45
• 1.1 对象与方法18-30
• 1.1.1 模板、载体、细胞株、菌株18
• 1.1.2 试剂及相关液体配制18-21
• 1.1.3 实验仪器及耗材21
• 1.1.4 实验方法21-30
• 1.2 结果30-41
• 1.2.1 衣壳蛋白Vp1的空间结构预测30-33
• 1.2.2 蛋白Vp1_(1-189)、Vp1_(190-502)基因克隆鉴定结果33-37
• 1.2.3 蛋白Vp1_(1-189)、Vp1_(190-502)的表达、纯化及鉴定37-39
• 1.2.4 衣壳蛋白Vp1表达、纯化及鉴定39-41
• 1.3 讨论41-44
• 1.3.1 衣壳蛋白Vp1空间结构及结合位点预测43
• 1.3.2 蛋白Vp1_(1-189)、Vp1_(190-502)的TA克隆43-44
• 1.4 小结44-45
• 二、衣壳蛋白Vp1及Vp1_(1-189)及Vp1_(190-502)对沙眼衣原体的作用检测45-58
• 2.1 对象与方法45-52
• 2.1.1 细胞株、沙眼衣原体株45
• 2.1.2 细胞培养所需试剂及相关液体配制45-46
• 2.1.3 仪器及耗材46
• 2.1.4 实验方法46-52
• 2.2 结果52-54
• 2.2.1 Vp1蛋白对沙眼衣原体最适作用浓52-53
• 2.2.2 Vp1蛋白对沙眼衣原体的作用结果53
• 2.2.3 Vp1、Vp1_(1-189)及Vp1190-502蛋白对沙眼衣原体的抑制作用比较53-54
• 2.3 讨论54-57
• 2.3.1 噬菌体的生命周期及其对宿主的影响54-55
• 2.3.2 噬菌体衣壳蛋白对衣原体的抑制作用55-57
• 2.4 小结57-58
• 结论58
• 论文创新点58-59
• 参考文献59-63
• 发表论文及参加科研情况说明63-64
• 综述 衣原体噬菌体及其与宿主细胞结合机制的相关研究64-74
• 综述参考文献71-74
• 致谢74-75
• 个人简历75

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